0 引 言
生物脱氮以其良好的经济与环境友好性成为废水脱氮最有效的方法[1-2]。传统的生物脱氮工艺包括硝化与反硝化2个过程，其中，由于功能不同的硝化细菌与反硝化细菌对氧、营养物质等的要求不同，使得传统的生物脱氮工艺往往存在流程复杂、操作管理要求高、能耗大、处理效果不稳定等问题[3-5]。近年来，一些新型高效的生物脱氮工艺逐步被发展起来，其中，好氧反硝化菌[6-7]的发现打破了反硝化过程只能在缺氧或厌氧条件下进行的限制，使得反应器在好氧条件下实现同步硝化与反硝化成为可能，在简化脱氮工艺的同时，大大提高了有机碳源的利用效率和反应器的处理效率，具有良好的发展前景。近年来分离出的大多数好氧反硝化菌以假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[8-11]、不动杆菌(Acinetobacter sp.)[12-13]、产碱菌属(Alcaligenes sp.)[14]、副球菌属(Paracoccus sp.)[15]为主，而具有好氧反硝化功能的无色杆菌(Achromobacter sp.)鲜有报道。
生物海绵铁体系是将海绵铁[16]以一定方式介入到活性污泥中所形成的复杂体系[17]。课题组长期研究发现，该体系在好氧条件下具有良好的脱氮效果[18]。为了揭示生物海绵铁体系的脱氮机理，从该体系中成功分离筛选出具有好氧反硝化功能的铁细菌H5，通过形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定，并在不同条件下对其进行反硝化性能测定,从而为这一技术的实际应用打下了良好的基础。
1 实验部分
1.1 实验材料
实验所用海绵铁购自北京某海绵铁厂，粒径选用3～5 mm，使用前进行预处理，即在1%的硫酸中浸泡20～30 min，期间不断搅拌，后用自来水冲洗数次，用以去除表面的细铁粉和杂质，直至上清液澄清无色，取出自然晾干后，备用。接种活性污泥取自兰州市某污水处理厂二沉池。
1.2 实验用水
模拟废水：以无机盐储备液为基础，由牛奶提供所需碳源。其中，无机盐储备液配比如表1所示。
表1 无机盐储备液配方
Table 1 Setup of the inorganic salt reserve solution g/L
试剂K2CO3(NH4)2SO4NaHCO3KH2PO4K2HPO4加量6464323.849.728
0.85%生理盐水：按0.85∶1的配比将0.85 g的NaCl加入100 mL去离子水摇匀，用棉布包扎后高压灭菌30 min，以备用。
1.3 培养基
1)LB培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH调至7.2。
2)Winogradsky铁细菌培养基：NH4NO3 0.5 g/L；NaNO30.5 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；CaCl2 0.2 g/L；K2HPO4 0.5 g/L；柠檬酸铁铵10 g/L；pH值调至7.2。
3)BTB培养基：1%溴百里酚蓝BTB试剂1 mL，丁二酸钠8.5 g/L,KNO3 1 g/L，KH2PO4 1 g/L, FeCl2·6H2O 0.5 g/L, CaCl2·7H2O 0.2 g/L, MgSO4·7H2O 1 g/L，pH值调至7.2。
4)反硝化培养基(DM)：丁二酸钠2.8 g/L，KNO3 0.72 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH值调至7.2。
若配制固体培养基，则在上述培养基中加入20 g/L琼脂。以上培养基均于(121±1) ℃下灭菌20 min，冷却后备用。上述操作均在无菌条件下进行。
1.4 实验方法
1.4.1 菌种的富集
平行启动2个有效容积为4 L的反应器，1号反应器为投加2.5 g/L活性污泥的对比体系，2号反应器为投加2.5 g/L活性污泥和90 g/L海绵铁的生物海绵铁体系，采用底部曝气方式进行充氧，控制ρ(DO)在2～4 mg/L。整个反应均在室温下进行，运行周期为12 h，换水比为1/2。待2号反应器氨氮
降解率达到90%以上时，进行菌株的分离与筛选。
1.4.2 菌株的分离、筛选
将2号反应器中的泥水混合物置于离心机以4000 r/min转速离心后，倾去上清液，称取4 g活性污泥于50 mL生理盐水的锥形瓶中，置于摇床(140 r/min)下振荡30 min。通过倍比稀释、涂布BTB平板，挑取BTB培养基上带蓝色晕圈的单菌落，并进行划线分离，将纯化后的单菌落接种至斜面，置于4 ℃冰箱中低温保存。根据菌落形态的不同，分离纯化数次后得到 17 株具有好氧反硝化能力的菌株。
将分离出的17株好氧反硝化菌再次培养成菌液，分别涂布于Winogradsky铁细菌固体培养基上，在30 ℃下培养48 h后，经多次划线，最终鉴定出7株具有铁氧化功能的好氧反硝化细菌。
1.4.3 菌株反硝化作用测定
对分离出的7株BTB阳性菌分批在以KNO3为唯一氮源、琥珀酸钠为碳源条件下，进行反硝化实验，最终筛选得到1株好氧反硝化能力较强的菌株H5。
1.4.4 菌株的鉴定
将菌株H5依据《常见细菌系统鉴定手册》[19]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[20]对其进行形态学及生理生化性能鉴定。
用细菌基因组DNA试剂盒提取菌株H5的DNA作为16S rDNA的扩增模板，通过正向引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。
PCR反应体系(50 μL): 正向引物27F(10 μmol/L) 1.5 μL：反向引物 1492R(10 μmol/L) 1.5 μL; 2 × Tap PCR MasterMix 25 μL：细菌DNA模板1 μL; ddH2O 39 μL。
PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃延伸7 min。
将PCR 扩增产物采用AxyPrep DNA凝胶试剂盒进行纯化后测定，测序结果提交至GenBank数据库，进行Blast序列比对分析，检索其同源性序列。
1.4.5 菌株反硝化特性研究
实验控制单一变量(接种量10%，碳源为酒石酸钾钠，C/N为17，温度为30 ℃，pH值为7，海绵铁投加量为1 g/L，改变其一)，通过考察不同碳源(甲醇、柠檬酸三钠、葡萄糖、乙酸钠、酒石酸钾钠、丁二酸钠)、C/N(1∶1，5∶1，8∶1，11∶1，14∶1，17∶1，20∶1，25∶1)、温度(20，30，35 ℃)，pH(5、6、7、8)以及海绵铁投加量(0，0.3，1，3 g/L)对菌株反硝化特性的影响。
1.5 测定方法
细胞生长(OD600)的测定采用吸光光度法；总氮(TN)的测定采用碱性过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度计法；硝酸盐氮
的测定采用紫外分光光度法；亚硝酸盐氮
的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[21]。
2 结果与讨论
2.1 菌株的形态学鉴定
经分离筛选后得到7株具有铁氧化功能的好氧反硝化功能菌株，其在BTB培养基上培养4 d的菌落形态特征如表2所示。
表2 菌株的菌落特性
Table 2 Colony characteristics of the strains
编号菌落尺寸/mm颜色形状表面结构边缘H10.3微蓝圆中部凸起完整H24.0蓝色扁中部凸起不完整H35.0蓝色扁中部凸起完整H42.5微蓝圆光滑完整H57.0微蓝圆中部凸起完整H62.5微蓝扁边缘褶皱不完整H77.0微蓝扁边缘不齐不完整
2.2 分离菌株的好氧反硝化性能测定
按8%的接种量将菌株H5接于反硝化培养基(DM)中，筛选出7株具有好氧反硝化功能的铁细菌，其反硝化实验结果如表3所示。
表3 菌株反硝化性能测定
Table 3 Determination of denitrification capability of the strains mg/L
菌株号初始培养时NO-3-N培养结束时NO-3-NNO-2-NNO-3-N去除率/%H1112.417.9352.4945.03H2104.4221.4252.9541.33H3106.435.3463.5353.30H4115.3414.0531.9349.29H5121.041.0926.0440.31H6119.4317.2053.9472.32H7107.4510.4253.4178.49
由表3可知：菌株H5在培养48 h时，体系中
去除率为72.32%，并且整个过程中
浓度保持在较低水平。故选取菌株H5进行后续实验。
2.3 菌株H5的鉴定
2.3.1 菌落形态及生理生化鉴定
菌落在平板上呈圆形、表面凸起，周边整齐，颜色为乳白色，直径为2～4 mm；革兰氏染色呈阴性；氧化酶、接触酶、葡萄糖氧化发酵、硝酸盐还原实验呈阳性；明胶液化、产硫化氢、尿素水解、甲基红实验、氰化钾实验、产吲哚呈阴性。
2.3.2 16S rDNA测序及系统发育分析
菌株H5的16S rDNA基因全长1089 bp，将所得的基因序列提交至GenBank进行Blast检索，通过序列比对分析，菌株H5与Achromobacter denitrificans strainTB的亲缘性很近，并结合菌株的形态特征和生理生化特征，可鉴定菌株H5为反硝化无色杆菌属(Achromobacter denitrificans sp.)。
2.4 菌株脱氮特性影响因素分析
2.4.1 碳 源
菌株对不同碳源的利用率有一定差别。如图1所示，菌株H5分别以甲醇、柠檬酸三钠、葡萄糖、乙酸钠、酒石酸钾钠、丁二酸钠为唯一碳源时，菌株H5均能生长。当碳源为葡萄糖时，对
去除率达到最高为95.40%，但系统内
的积累较高，达到70.23 mg/L。当碳源为酒石酸钾钠时，菌株H5对TN去除率达到最高，为72.67%，对去除率相对较高，为89.70%，且菌株生长量较高；碳源为柠檬酸三钠时，菌株H5的OD600值最高，生长状况最好，这与许涛等[22]研究中菌株Diaphorobacter sp.PDB3以柠檬酸三钠为碳源时菌株具有最大细胞比生长速率结果一致，但其积累量较高，TN去除率仅为44.72%，因此不能被菌株H5很好地利用。综上所述，菌株H5利用酒石酸钾钠为碳源时总氮去除率和细胞生长量均较高，积累量最少，表明它可被菌株很好地利用，因此，确定菌株H5的最佳碳源为酒石酸钾钠。
OD600； 
TN； 
图1 碳源对菌株H5生长及脱氮性能的影响
Fig.1 Effect of carbon source on growth and nitrogen removal performance of strain H5
2.4.2 C/N
好氧反硝化菌对碳氮比的适应范围较广，在一定范围内，碳源浓度越高，菌株生长越好，脱氮效率越高；但超过一定范围，碳源浓度的继续增加对菌株的生长和脱氮率影响不大[23-24]。如图2所示，随着C/N的增高，菌株H5的生长量、TN和的去除率逐渐升高，说明适当地提高碳氮比有利于菌株的生长和脱氮；当C/N为17时菌株的生长量达到最大为1.192，TN和的去除率也达到最大，分别为80.07%、97.71%。随着C/N的继续增高，菌株的生长量和脱氮率无明显增加，且随着C/N的增高呈先下降后上升的趋势，并在C/N为17时积累量最低。因此，菌株H5的最佳C/N为17，这与孙庆花等[25]的研究结果相一致。
OD600； TN；
图2 C/N对菌株H5生长及脱氮性能的影响
Fig.2 Effect of carbon to nitrogen ratio on growth and nitrogen removal performance of strain H5
2.4.3 pH
pH值的变化与微生物的生命活动密切相关，它不仅可影响参与微生物生命活动中的各种酶活性，同时能够引起微生物细胞膜电位的变化，进而影响微生物吸收营养物质的能力[26]；此外，pH过高或过低都会影响微生物脱氮过程中酶的活性，从而影响菌株的脱氮能力[27-28]。如图3所示，pH为5时，菌株生长缓慢，其脱氮效率较低，有部分积累；pH在6～8时对菌株H5的影响有限，OD600都在1.2以上，TN及去除率普遍较高，分别均高于86%和89%，且均无积累。当pH为7时，菌株H5 OD600达到最大为1.353，TN及去除率也达到最大分别为94.73%、98.47%。表明该菌株在中性环境下具有较好的适应性。
OD600； TN；
图3 pH对菌株H5生长及脱氮性能的影响
Fig.3 Effect of pH on growth and nitrogen removal performance of strain H5
2.4.4 温 度
温度是微生物生长繁殖及脱氮过程中酶活性的重要影响因子，进而影响其脱氮效率，大多数微生物最适宜生长温度为20～35 ℃[29-30]。如图4所示，温度在20 ℃时，菌株几乎不生长，脱氮效率较低，TN去除率仅为
去除率为29.11%；当温度升至30 ℃时，菌株H5的OD600为1.353，TN和
去除率达到最大分别为92.21%、100%；温度升至35 ℃时，OD600达到最大为1.365，TN和去除率有所下降，分别为85.24%、85.72%，且有一定的
积累，说明该菌株最适生长温度与脱氮最适温度不同，高温抑制了脱氮体系中酶的活性。综上所述，菌株H5的最适温度为30 ℃。
OD600； TN；
图4 温度对菌株H5生长及脱氮性能的影响
Fig.4 Effect of temperature on growth and nitrogen removal performance of strain H5
2.4.5 海绵铁投加量
铁是微生物生命活动中不可或缺的元素，同时也是生物氧化酶系中细胞色素的重要组成部分[17]。研究表明，一些金属离子的加入可大幅提高菌体对氮的去除率[31-32]。因此，本实验考察海绵铁投加量对菌株生长及脱氮性能的影响。
如图5所示，TFe随着海绵铁加量的增加而呈上升趋势，在海绵铁投加量为3 mg/L时最大，为23.15 mg/L，由于Fe3+在好氧条件下易转化为Fe3+，而使得系统亚铁保持较低水平。如图6所示，随着海绵铁加量的增加，体系中Fe2+的溶出量增加，菌株H5的D600值也逐渐升高，最终达到1.589，TN和
去除率总体分别高于88%、95%，且当海绵铁投加量为1 mg/L时达到最大，分别为95.08%、100.00%，且
的积累量几乎为0，因此海绵铁的加入有利于菌株2～5的生长及对氮的去除，且最佳投加量为1 mg/L。
—TFe; 
—Fe2+。
图5 海绵铁加量对系统TFe、Fe2+浓度影响
Fig.5 Effect of sponge iron dosage on total iron and ferrous ion concentration in system
OD600； TN；
图6 海绵铁加量对菌株H5生长及脱氮性能的影响
Fig.6 Effect of sponge iron dosage on growth and nitrogen removal performance of strain H5
3 结 论
1)从生物海绵铁体系中分离筛选得到17株具有好氧反硝化能力的细菌，并鉴定出7株具有铁氧化功能的好氧反硝化菌株，进行菌株反硝化性能试验，最终筛选得到1株好氧反硝化能力较强的菌株H5。
2)菌株H5的革兰氏染色为阴性，经菌株形态观察和16S rDNA同源性分析，鉴定其属于反硝化无色杆菌属(Achromobacter denitrificans sp.)
3)经试验表明：菌株H5在碳源为酒石酸钾钠、C/N为17∶1、温度为30 ℃、pH为7时，对TN和具有较高的去除率，菌株生长较好，且同时的积累量较低；海绵铁的加入有利于系统对TN和的去除，且投加量在1 mg/L时达到最大，分别为95.08%、100.00%，且的积累量几乎为0。
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