0 引 言
2016年，我国CO2年排放量达到92.2亿t，占全球CO2排放总量的27.6%[1]，其中，近一半的排放量来自于煤电行业。燃煤电厂CO2减排对于我国中长期碳减排目标乃至于全球碳减排目标的实现，都具有重要意义。因具有较高的固碳效率和可持续的碳循环利用等特点，微藻固碳已成为CO2捕集和利用领域的热点之一[2-3]。微藻固碳生物质可进一步加工成生物乙醇、生物柴油等液体燃料[4]，实现CO2的资源化循环利用。燃煤电厂烟气中的CO2的体积分数为15%左右，对大多数藻类具有“麻醉”作用[5]，故耐受烟气高浓度CO2固碳藻株的选育是实现微藻固定燃煤电厂烟气的第一步。γ射线因具有较高的能量和较强的穿透性，已被用于多种固碳藻株的选育，提高微藻生长固碳速率和油脂含量等[6-7]。小球藻(Chlorella sp.)是较为常用的固碳产油藻株，常用淡水养殖，若可以采用海水养殖，不仅可以缓解巨大的淡水用水压力及其带来的高成本问题，而且可以降低生物污染风险。此外，一定的盐度压力还可以刺激生物质积累，促进微藻中油脂的合成代谢[8, 9]。
本文利用电厂循环冷却海水和15% CO2(体积分数, CO2/N2)培养经γ射线核诱变和高浓度CO2梯度驯化的小球藻突变藻株，探索燃煤电厂废水废气的资源化综合利用途径。
1 实验部分
1.1 60Co-γ射线辐射选育固碳藻株
实验所用的野生型小球藻购自中国科学院淡水藻种库(武汉)。野生型藻株置于60Co-γ射线下辐照诱变，辐照强度(Ie)分别为200，300，500，700，900 J/kg，将恢复生长后的诱变藻株接种至f/2固体培养基上，置于20 ℃、1000 Lux光照条件下培养，定向筛选高盐度耐受藻株，而后挑选出其中颜色最深、个体最大的菌落接种至96孔板中，依据生长速率筛选优良藻株。经2%～15% CO2梯度驯化后得到可以在15% CO2条件下快速生长的核诱变小球藻。
1.2 核诱变小球藻培养条件
培养核诱变小球藻所用的电厂循环冷却海水分别取自嘉兴电厂和台州电厂，其中，台州电厂循环冷却海水采样点取自2个不同位置，3种海水分别标记为嘉兴、台州1号、台州2号。培养温度为27 ℃，光照强度为8000 Lux，培养期间持续不断地通入15% CO2，气体流量为30 mL/min。
1.3 数据处理与计算
1.3.1 生长测试
96孔板中培养的微藻生长速率采用酶标仪(Tecan M200pro，瑞士)测定，以405 nm波长下的吸光度(OD405)表征微藻生物质密度。
生物质干重采用重量法测定。将小球藻离心收获，经去离子水洗涤2遍后，放入设定温度为80 ℃的烘箱中，烘干24 h，称量其生物质干重。依据生物质干重(BDW，g/L)计算固碳速率，计算方法如式(1)所示[7]：
RCO2=μ×CC×BDW×MCO2/MC
(1)
式中：μ为比生长速率，d-1；CC为生物质中的碳含量，%；MCO2为CO2的分子量；MC为C元素的分子量。
相对存活率(α)以辐照强度200 J/kg作为基准点，该条件下藻株的相对存活率为100%，其他辐照强度下藻株的相对存活率为其与200 J/kg辐照强度下存活率的比值。
1.3.2 主成分分析
对海水成分的离子浓度指标进行主成分分析(principle component analysis，PCA)，揭示不同成分对微藻生长的影响。
2 实验结果与讨论
2.1 核诱变选育固碳藻株
与紫外线和X射线相比，60Co-γ射线波长短，能量高，更容易引起DNA上的基因突变和染色体畸变，产生更多和更加多元化的突变体用于筛选目标藻株。如图1所示，随着γ射线辐照强度由200 J/kg提高至700 J/kg，小球藻的相对存活率逐渐降低，但恢复生长后的突变藻株的生长速率逐渐升高。700 J/kg辐照后藻株的生长速率较200 J/kg辐照后藻株的生长速率提高了27%。这是由于在高辐射剂量下，变异点位发生在基因层面的概率增加，变异幅度更大。γ射线可以改变质粒结构，进而刺激细胞内的卡尔文循环和PSⅡ过程[10]。γ射线还可以打碎细胞壁中的薄片，影响色素体的功能[11]，改变细胞的结构及代谢过程。然而，当辐照强度提高到900 J/kg后，γ射线对细胞造成不可逆损伤，生长速率较700 J/kg辐照下降低了28%。因此，选用700 J/kg辐照后的藻株作为后续实验藻株，通过高盐度定向筛选和高浓度CO2梯度驯化，得到可在15% CO2条件下快速生长的耐盐固碳藻株。
—OD405； 
—α。
图1 γ射线辐照强度对微藻生长的影响
Fig.1 Effect of γ radiation intensity on the growth of microalgae
2.2 电厂循环冷却海水成分与盐度
燃煤电厂循环冷却海水中含有大量泥沙，不宜直接用于培养微藻。将海水进行自然沉降，不同时间下自然沉降结果如图2所示。可知：经过1 h自然沉降后，电厂循环冷却海水中的大部分悬浊物已沉降；4 h后，悬浊物已全部沉降。上清液成分分析结果表明：嘉兴和台州两地电厂的循环冷却海水离子浓度比例与标准海水相近，阳离子中Na+比例最高，约为30%，阴离子中Cl-比例最高，为55%。两地电厂循环冷却海水的盐度差异较大，嘉兴盐度仅为0.50%，而台州1号和台州2号的盐度分别为1.75%和1.12%，但嘉兴和台州两地循环冷却海水的盐度均低于f/2海水培养基盐度(3.25%，相当于深海海水盐度)。这是由于嘉兴电厂和台州电厂循环冷却海水均取自江河入海口处，已被入海淡水稀释。盐度在一定程度上影响藻类的渗透压、营养盐的吸收及其悬浮性，过高或过低的海水盐度均会对藻细胞造成伤害[12-13]。综上所述，循环冷却海水不需要消耗额外的能量分离泥沙，沉降后的上清液即可用于固碳微藻的培养。
图2 电厂循环冷却海水的自然沉降结果
Fig.2 Natural sedimentation of recirculating cooling seawater from power plants
2.3 电厂循环冷却海水培养核诱变小球藻
图3所示为营养盐对电厂循环冷却海水培养小球藻的影响。可知：利用泥沙自然沉降后电厂循环冷却海水上清液培养的核诱变小球藻生长缓慢，经过6 d培养，生物量密度仅增加了0.1 g/L，这是由于海水中营养盐缺乏导致的。氮缺乏导致藻细胞内叶绿素总量减少，对光照强度和CO2需求降低，光合作用和呼吸作用均减弱；磷缺乏导致光合作用的光能吸收、卡尔文循环、同化力形成、同化产物运输等过程受到抑制[14]。加入了氮、磷营养盐后，电厂循环冷却海水中培养的核诱变小球藻生物质干重达到1.67 g/L；最大比生长速率为1.42/d，最大生物生产力为0.72 g/(L·d)，与f/2海水培养基培养条件相比，分别提高了10%和28%。这可能是由于海水盐度不同造成的。研究表明，核诱变小球藻的生长固碳速率受盐度影响显著(图4)。由于f/2海水培养基的盐度较高，微藻生长出现滞后期，导致固碳效果显现缓慢。电厂循环冷却海水培养核诱变小球藻的最大固碳效率为0.68 g/(L·d)，为同期f/2海水培养基培养微藻固碳效率的1.9倍。盐度的增加会影响微藻的电子传递速率，引起反应中心色素降解和捕光色素的降解，导致PSⅡ实际光化学效率降低，光合作用效率下降[15]。
—海水； 
—f/2培养基； 
—添加氮、磷海水。
图3 营养盐对电厂循环冷却海水培养核诱变小球藻的影响
Fig.3 Nutrient effect on the growth of Chlorella sp. mutant cultured in circulating cooling seawater from power plants
—3.25%； —1.75%； —1.12%； 
—0.5%。
图4 电厂循环冷却海水盐度对核诱变小球藻固碳速率的影响
Fig.4 Salinity effect on the carbon fixation rate of Chlorella sp. mutant cultured in circulating cooling seawater from power plants
在微藻工程化培养中，为降低细菌、浮游动物、杂藻和病毒入侵等生物污染风险，生产中一般在微藻接种之前采用过滤或添加漂白粉的方法对培养水体进行简单处理，但由于受漂白时间、有效氯浓度过低等因素影响，培养水体中会残留大量污染物，影响微藻生长。而对比灭菌和未灭菌的电厂循环冷却水培养的微藻发现(图5)，两者的生长趋势一致，微藻生长并未受到生物污染的影响。这说明利用电厂循环冷却海水不仅可以降低微藻过程中淡水用水压力，还可以避免多种淡水微生物的生物入侵，简化养殖工艺，降低生产成本。
—添加氮、磷灭菌海水； —添加氮、磷海水； 
—f/2培养基。
图5 核诱变小球藻对电厂循环冷却海水的适应性
Fig.5 Adaptability of Chlorella mutant to circulating cooling seawater from power plants
2.4 电厂循环冷却海水成分对核诱变小球藻生长的影响
利用电厂循环冷却海水中
的离子浓度指标，通过主成分分析，研究海水成分对核诱变小球藻生长的影响，结果如图6所示。通过PCA对6个指标变量的预分析，第1变量和第2变量分别解释了总信息量的99.40%和0.59%，基本完全代表了6个指标变量的信息。第一主成分与6个指标变量均具有强烈的正相关性，说明第一主成分与生物量密度成正相关。第二主成分与
具有正相关性，与Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Cl-具有负相关性。相比之下，对第二主成分具有正向的促进作用。
a—嘉兴; b—台州1号; c—台州2号; d—f/2。
图6 电厂循环冷却海水成分和核诱变小球藻生物质
干重的PCA分析
Fig.6 PCA analysis between biomass dry weight of Chlorella sp. mutant and the composition of circulating cooling seawater from power plants
对主成分进一步分析，根据主成分分析的相关性生物质干重的评价指标可表示为：
PCs=0.994PC1+0.0059PC2
(2)
根据萃取特征向量，第一主成分和第二主成分与原有的6个指标变量的线性关系式为：
PC1=0.40936c(Na+)+0.40917c(Mg2+)+
0.40908c(K+)+0.40935c(Ca2+)+
(3)
0.2053c(Mg2+)-0.22595c(K+)-
0.03504c(Ca2+)-0.28841c(Cl-)
(4)
由式(2)—(4)可知：对第一主成分具有的贡献基本相同，Cl-相对稍高，相对稍低。在与第二主成分具有负相关性的指标变量中，Cl-的影响相对较大。因第一主成分信息量占有较大比重，可以判断，以微藻对数生长末期为例，随着海水中离子浓度总量的增加，生物质干重降低(d点生物质干重为1.10 g/L，a点生物质干重为1.44 g/L)，即在一定范围内，生物质干重随着盐度的增加而降低。
3 结 论
1)利用60Co-γ射线核诱变选育小球藻高效固碳藻株，在辐照剂量700 J/kg下获得生长速率较高的核诱变藻株，其生长速率较200 J/kg辐照下提高了27%；添加氮、磷营养盐的电厂循环冷却海水适用于培养核诱变小球藻固定燃煤电厂15% CO2，其比生长速率和固碳速率分别可达1.42/d和0.68 g/(L·d)；通过海水成分对生物量密度的主成分分析，发现各组分对含有99%以上信息量的第一主成分均具有正相关性，且贡献基本相当。
2)研究的微藻固碳特性及海水成分对微藻生长的影响，不但选出了高效率的固碳藻株，提供了海水养殖微藻的培养基，而且证明了利用循环冷却海水培养微藻固定煤电15% CO2可能性，为燃煤电厂废水废气资源化综合利用提供了新思路。
3)研究成果为微藻固定电厂实际排放CO2的工程化应用提供了基础资料，但产业化所需的反应装置、海水循环系统设计及如何利用太阳光高效固定CO2还有待进一步深入研究。
[1] BP.2017年BP世界能源统计年鉴[EB/OL]. https://www.bp.com/zh_cn/china/bp-in-china.html.BP.
[2] Geetanjali Y, Ankush K, Kumar Dash S, et al. Performance evaluation of a green process for microalgal CO2 sequestration in closed photobioreactor using flue gas generated in-situ[J]. Bioresource Technology, 2015, 191: 399-406.
[3] Li F F, Yang Z H, Zeng R, et al. Microalgae capture of CO2 from actual flue gas discharged from a combustion chamber[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2011, 50(10): 6496-6502.
[4] 朱顺妮，王亚杰，黄伟，等. 缺氮培养对小球藻碳水化合物和油脂积累的影响[J]. 太阳能学报, 2016(8): 2118-2122.
[5] Cheah W Y, Show P L, Chang J, et al. Biosequestration of atmospheric CO2 and flue gas-containing CO2 by microalgae[J]. Bioresource Technology, 2015, 184: 190-201.
[6] Cheng J, Huang Y, Feng J, et al. Mutate Chlorella sp by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2[J]. Bioresource Technology, 2013, 136: 496-501.
[7] Cheng J, Li K, Yang Z, et al. Enhancing the growth rate and astaxanthin yield of Haematococcus pluvialis by nuclear irradiation and high concentration of carbon dioxide stress[J]. Bioresource Technology, 2016, 204: 49-54.
[8] Cheng R, Feng J, Zhang B, et al. Transcriptome and gene expression analysis of an oleaginous diatom under different salinity conditions[J]. Bioenergy Research, 2014, 7(1): 192-205.
[9] Luangpipat T, Chisti Y. Biomass and oil production by Chlorella vulgaris and four other microalgae：effects of salinity and other factors[J]. Journal of Biotechnology, 2017, 257: 47-57.
[10] Agarwal R, Rane S S, Sainis J K. Effects of 60Co gamma radiation on thylakoid membrane functions in Anacystis nidulans[J]. Journal of Photochemistry And Photobiology B-Biology, 2008, 91(1): 9-19.
[11] Kovacs E, Keresztes A. Effect of gamma and UV-B/C radiation on plant cells[J]. Micron, 2002, 33(2): 199-210.
[12] 包杰，田相利，董双林，等. 温度、盐度和光照强度对鼠尾藻氮、磷吸收的影响[J]. 中国水产科学, 2008,15(2): 293-300.
[13] 郭瑾，杨维东，刘洁生，等. 温度、盐度和光照对球形棕囊藻生长和产毒的影响研究[J]. 环境科学学报, 2007,27(8): 1341-1346.
[14] 潘晓华，石庆华，郭进耀，等. 无机磷对植物叶片光合作用的影响及其机理的研究进展[J]. 植物营养与肥料学报，1997，3(3): 201-208.
[15] Cheng J, Li K, Yang Z, et al. Gradient domestication of Haematococcus pluvialis mutant with 15% CO2 to promote biomass growth and astaxanthin yield[J]. Bioresource Technology, 2016, 216: 340-344.