0 引 言
水环境基准是制定水质标准的科学依据，在国家环境质量评价和风险管理体系中处于基础地位[1]。目前学者在研究环境基准时不仅关注生物毒性数据的数量与质量[2-4]，本地物种和非本地物种敏感性[5-6]、常规测试指标和非常规测试指标差异[7-8]、模型方法[9-10]等方面的研究、而且对水环境因子如DOC含量[11]、硬度[12]、pH值[13]、温度[14]和盐度[15]等对污染物(特别是金属污染物)影响毒性也有了非常系统的研究，取得了包括FIAM(自由离子活度模型)、BLM(生物配体模型)等重要理论成果[16]。
以金属铜水质基准研究为例，如果考虑每个水环境因子对金属铜毒性的影响，将增加巨大的监测成本。美国在研究将生物配体模型应用于毒性预测时指出，铜的水生生物毒性对DOC最敏感，pH值其次，最后是钙、镁和钠的混合浓度[17]，但该研究结果是基于美国水环境因子分布得出的结论。而我国幅员辽阔，地形复杂，各地水环境因子[18-21]，如硬度、DOC含量、pH值、温度、碱度等差异较大，有必要结合我国主要水体实际情况，评估我国主要水域水环境因子变化对金属污染物水生生物毒性的影响情况。
根据已有研究成果，选择水体硬度、DOC含量和pH作为影响铜对水生生物毒性变化的主要水环境因子[22]。结合我国地表水主要水环境因子分布规律，应用累积概率分布曲线，选取各个水环境因子在我国地表水5%和50%累积概率分布区间，在此基础上通过实验和模型预测对应概率的毒性数据，比较各个水环境因子在累积概率变化下对毒性数据的影响大小，研究结果对我国水质基准的制修订具有重要参考价值。
1 实验部分
1.1 实验材料
五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)购于上海国药试剂厂，优级纯；腐殖酸(Humic Acid)购于Sigma-Aldrich，分析纯；氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钾(KCl)等试剂购于国药集团，分析纯；铜标准溶液购于国家标准物质网。AB系斑马鱼(Danio rerio)购自中科院水生生物研究所，在实验室流水养鱼系统自行繁殖。
1.2 仪器设备
YSI Professional Plus多参数水质分析仪(美国赛莱默分析仪器)；PHS-3E 酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；MGC-350HP-2人工智能气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)；CASA流水养殖系统(无锡中科水质环境技术有限公司)；Agilent 7500a电感耦合等离子体质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Multi N/C3100 TOC分析仪(德国耶拿分析仪器股份公司)。
1.3 实验方法
斑马鱼急性毒性实验参照GB/T 13267—91《水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》[23]，实验温度为(25±1) ℃，光强为1000 lux，光暗比为16 h∶8 h。暴露实验采用超纯水配制的重组水，不同硬度(H)的重组水通过改变水中Ca2+和Mg2+的浓度来实现，不同DOC含量的重组水通过添加DOC储备液溶液[24]来实现，不同pH值的重组水通过添加HCl(0.1 mol/L)或NaOH(0.1 mol/L)来实现。重组水配好后曝气24 h，测量溶解氧和pH值。每个实验至少设置5个暴露浓度和1个空白，每个暴露浓度设置3个平行，每个平行放入10尾斑马鱼，每24 h更换1次暴露液，并对暴露液中铜浓度取水样实测。观察记录24，48，72，96 h 斑马鱼死亡的数目 (用玻璃棒轻触鱼的尾部, 没有反应即认为已死亡)，及时清出死鱼。试验过程中，空白组死亡率<10%。
1.4 数据收集与累积概率分布曲线构建
参照我国主要流域重点断面划分情况，以珠江流域、长江流域、黄河流域、淮河流域、辽河流域、海河流域、松花江流域、浙闽河流、西南诸河，以及太湖、巢湖、滇池、鄱阳湖、洞庭湖、洱海、抚仙湖等各大湖泊为关键词，通过检索Web of Science、中国知网等数据库查找已发表的论文期刊和各环境监测网站等获取地表水硬度、DOC含量和pH值的数据。除pH值数据采用148个主要流域重点断面的实时测量值进行累积概率分布曲线拟合外，其他数据筛选基本要求为：1)所收集测量数据必须包含采样地点、采样时间等必要信息，采用可靠的实验测量方法，并能换算成统一的标准单位；2)优先考虑以主要流域重点断面为采样点的测量值，补充其他地点作为采样点的测量值；3)不得使用水体严重污染的测量值；4)同一采样点，多个测量值，若测量值相差10倍以上，则需要将边界外的值剔除；5)同一流域，不同采样点，按照水源来判断，水源相同，按同一点位处理，水源不同，按不同点位处理；6)同一采样点，多个测量值，区分枯水期和丰水期采样的，选取枯水期几何平均值和丰水期几何平均值分别作为该点位代表测量值，不区分枯水期和丰水期的，取全部几何平均值作为该点位代表测量值。
以硬度为例，介绍我国主要流域地表水硬度累积概率分布曲线构建：将符合筛选要求的地表水点位硬度值的平均值按照各地表水点位硬度值大小进行排序，计算每个地表水点位硬度值的累积概率，如式(1)所示：
累积概率=i/(n+1)
(1)
式中：i为地表水点位硬度值在全部地表水点位中的排序；n为全部地表水点位硬度值的数量。以各地表水点位的硬度值为横坐标，以其对应的累积概率为纵坐标，构建地表水硬度累积概率分布曲线，通过外推求得累积概率为5%～90%的硬度值。
1.5 数据处理
利用OriginPro 8.0对筛选的主要流域地表水硬度、DOC含量和pH的实际值与对应的累积概率分布情况作图，并运用软件提供的模型对数据进行方程拟合。实验所得毒性数据采用SPSS 22.0 软件Probit方法计算暴露实验96 h的半致死浓度及其95%置信区间，并利用一元线性回归分析半致死浓度与水环境因子的相关性。
2 结果与讨论
2.1 我国主要流域地表水主要水环境因子累积概率分布
通过文献和部门监测网站收集数据，经过数据筛选，获得我国主要流域地表水硬度测量值195个，其中地表水硬度值最小值为27.6 mg/L，最大值为1007.3 mg/L，几何均值为112.10 mg/L；获得主要流域地表水DOC含量测量值484个，其中地表水DOC含量最低为0.64 mg/L，最高为45.17 mg/L，几何均值为3.64 mg/L；获得主要流域地表水pH值数据148个，其中地表水全年平均值pH分布最低为6.83，最高为9.49，几何均值为7.77。
将经过筛选整理的硬度、DOC含量和pH值等数据作累积概率分布图(图1)，并运用软件提供的模型方程对各个水环境因子数据进行方程拟合。研究结果发现：调查的3个水环境因子在我国主要流域地表水测量值分布均符合S型逻辑斯谛方程，且相关系数最高，模拟方程及相关系数见图1。通过模型拟合计算得到，我国主要流域地表水硬度累积概率为5%、10%、50%和90%的值分别为52.54，64.37，115.90，193.19 mg/L(图1a)，80%的点位分布在64.37～193.19 mg/L区间；我国主要流域地表水DOC含量累积概率为5%、10%、50%和90%的值分别为0.92，1.28，3.40，10.33 mg/L(图1b)，80%的点位分布在1.28～10.33 mg/L；我国主要流域地表水累积概率为5%、10%、50%和90%的pH值全年平均值分别为7.01、7.20、7.76和8.31(图1c)，80%的点位分布在7.20～8.31。
图1 我国主要流域地表水硬度、DOC含量和pH值累积概率分布
Fig.1 The cumulative probability distribution of hardness, DOC concentration and pH value in surface waters of China
2.2 不同水环境条件下Cu2+对斑马鱼急性毒性
以斑马鱼作为实验用鱼，研究了硬度为50，125，250，350，450 mg/L(以CaCO3计)水质条件下Cu2+对斑马鱼急性毒性，结果显示随着水体硬度的增加，Cu2+对斑马鱼急性毒性降低，如图2a所示，Cu2+对斑马鱼急性毒性与水质硬度呈显著线性关系(R2=0.97)。并研究了标准稀释水DOC含量为0，0.48，0.82，1.64，2.75 mg/L水质条件下Cu2+对斑马鱼急性毒性，结果显示，随着DOC含量的增加，Cu2+对斑马鱼急性毒性降低，如图2b所示，Cu2+对斑马鱼的急性毒性与水体DOC含量呈显著线性关系(R2=0.98)，图中CDOC表示水体DOC实际含量。研究了标准稀释水下初始pH值为6.20、7.00、7.76、8.80的水质条件下Cu2+对斑马鱼急性毒性，结果如图2c所示。可知，Cu2+对斑马鱼急性毒性在初始pH值为6.2～7.76区间内随着pH值升高而降低，当pH值进一步上升后，Cu2+对斑马鱼急性毒性随着pH值升高而增大，Cu2+对斑马鱼急性毒性受水体pH影响，符合pH影响污染物生物毒性的倒U模型[13]。
图2 不同水质硬度、DOC含量和初始pH值条件下Cu2+对斑马鱼96 h-LC50变化
Fig.2 The toxicity (96 h-LC50) changes of zebrafish to Cu2+ under different hardness, DOC concentration and initial pH value
2.3 基于累积概率分布评估典型水环境因子对金属毒性的影响大小
研究发现，硬度和DOC含量均与水体金属毒性呈负相关，因此研究5%以上累积概率与水环境因子的毒性关系，将能涵盖绝大部分地区水环境因子对毒性变化的影响情况。将我国地表水硬度、DOC在累积概率分别为5%、50%和90%的值用于计算斑马鱼的急性毒性。由于未找到合适的模型方程来模拟不同初始pH值与Cu2+对斑马鱼急性毒性的关系，但是在相应区间内，初始pH值与Cu2+对斑马鱼急性毒性符合倒U模型，因此通过给出对应初始pH值条件下Cu2+对斑马鱼96 h-LC50的真实值确定区间范围内的最大值或最小值，来计算其变化情况，计算实验结果见表1。
表1 我国地表水环境因子不同累积概率下Cu2+对斑马鱼毒性变化
Table 1 The toxicity changes of zebrafish to Cu2+ under different cumulative probability distribution of water quality conditions in China
累积概率硬度DOC初始pH值硬度值/(mg·L-1)预测96 h-LC50/(mg·L-1)DOC值/(mg·L-1)预测96 h-LC50/(mg·L-1)初始pH值96 h-LC50/(mg·L-1)5%52.540.1140.920.4357.010.16710%64.370.1241.280.5107.20—50%115.900.1653.400.9507.760.32790%193.190.24710.332.3888.31>0.217
通过表1预测值计算得出：硬度、DOC含量和pH值在累积概率为5%～50%，Cu2+对斑马鱼96 h-LC50的变化幅度分别为1.45，2.18，1.96倍，即我国主要流域地表水环境因子中，铜对斑马鱼毒性的影响受DOC含量影响程度高于pH值和水体硬度。
水环境因子对污染物的生物有效性影响规律被越来越多的科学家发现和证明[25]。研究表明：水环境中硬度离子(如Ca2+、Mg2+)与致毒金属离子存在竞争，能抑制金属离子进入生物体，降低金属离子生物毒性。另外，US EPA将水体硬度作为研究重金属水质基准是必须考虑的因素，而DOC能够与水体中金属离子络合，极大地降低了金属离子的生物毒性[16]。水体pH主要影响致毒金属离子的存在形式，高浓度质子也会破坏生物体内离子平衡，造成生物死亡[26]。因此，硬度和DOC含量能够抑制水体中金属的生物毒性，而在酸性情况下，大部分金属的生物毒性高于碱性。水体硬度、DOC含量和pH也是影响水体金属生物毒性最重要的因素[27]。我国幅员辽阔，各地区水环境条件差异巨大，评估各水环境因子对生物毒性的影响对水环境管理分区域实施具有重要意义。研究结果得出：DOC含量是我国地表水环境因子Cu2+对斑马鱼毒性的最显著影响因素，该结果与美国EPA制定Cu的淡水水生生物环境质量基准[17]和评估缺少BLM模型水环境因子的建议草案技术文件[28]的结果一致，可为我国水环境质量标准分区域制修订提供重要参考。
3 结 论
1)我国主要流域地表水硬度为27.6～1007.3 mg/L，几何均值为112.10 mg/L；DOC含量为0.64～45.17 mg/L，几何均值为3.64 mg/L；pH值为6.83～9.49，几何均值为7.77。
2)水体中硬度和DOC含量与Cu2+对斑马鱼毒性呈显著线性关系，可用一级线性方程进行拟合；Cu2+对斑马鱼急性毒性在初始pH值为6.2～7.76，随着pH值升高而降低，当pH值进一步上升后，Cu2+对斑马鱼急性毒性随着pH值升高而增大，呈倒U型。
3)不同水环境因子的对比研究表明，DOC含量是我国地表水环境因子Cu2+对斑马鱼毒性的最大影响因素。将文献、历史监测资料与现场测量相结合，研究我国主要流域近年的硬度、DOC和pH值的分布情况和变化规律，可为我国水环境质量标准的分区域制修订提供重要参考。
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