摘要：以无机基质培养的厌氧氨氧化污泥为对象，研究污泥投量、DO、BOD5/N和粒径等因素对其反硝化降解
活性的影响。通过高通量测序技术获得细菌的种群结构状况，其中主要的厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia fulgida和Candidatus Brocadia caroliniensis。批式实验结果表明：DO是厌氧氨氧化污泥异养反硝化最重要的限制性因素，ρ(DO)=0.12 mg/L是实现反硝化反应的界限；碳源浓度对厌氧氨氧化污泥异养反硝化的影响较小，碳源充足时，厌氧氨氧化污泥的异养反硝化活性受细菌数量限制，碳源不足时，混合菌群也可以充分利用原水碳源反硝化；从粒径角度分析得出，相对于底物扩散，微量氧对厌氧氨氧化污泥反硝化的限制更大。
厌氧氨氧化作为生物脱氮研究领域最具可持续性的工艺，以及被认为是自然界氮素循环的主要通道而受到广泛关注[1-3]。厌氧氨氧化在包括沼液[4]、垃圾渗滤液[5]、污泥脱水上清液[6]等各类高氨氮实际废水处理的应用研究表明，经培养驯化，厌氧氨氧化菌具有较好的环境适应能力和氮去除能力。在低C/N的实际废水处理研究中，基于结构简单和管理方便，较多研究者倾向选择同步实现短程硝化(partial-nitrification, PN)、厌氧氨氧化、异养反硝化3个过程耦合的单级自养脱氮系统[7-9]。基于高游离氨抑制[10]和低氧控制[11]的稳定PN是整个单级脱氮系统稳定的关键；厌氧氨氧化菌利用PN产生的亚硝酸盐和原水氨氮生成N2；而包含厌氧氨氧化菌在内的反硝化菌则利用原水中的有机碳源反硝化去除厌氧氨氧化过程产生的硝酸盐，实现TN的深度去除[12，13]。
关于厌氧氨氧化菌的异养反硝化，Kartal等[14]的研究结果表明，在小分子有机酸存在条件下，厌氧氨氧化菌不仅可以反硝化去除亚硝酸盐和硝酸盐，而且还具有常规异养反硝化菌所不具备的低细胞产率特征。因此，如果单级同步脱氮系统充分发挥厌氧氨氧化菌的异养反硝化功能，就可减少其他异养菌对TN去除的贡献，避免有机物相对充足时异养反硝化菌过量繁殖并替代厌氧氨氧化菌。但是，如何充分发挥厌氧氨氧化菌的异养反硝化功能，目前鲜见报道。
为了减少其他细菌对厌氧氨氧化菌异养反硝化活性的影响，本次试验采用完全无机基质培养的厌氧氨氧化污泥开展
异养反硝化研究。首先，采用高通量测序解析厌氧氨氧化污泥的种群结构；然后，以乙酸钠为有机碳源，通过批式试验中降解速率的变化揭示污泥投量、DO、BOD5/N和粒径等因素对污泥异养反硝化活性的影响，从而为厌氧氨氧化菌(AAOB)更高效、稳定地发挥其脱氮功能提供参考。
试验用泥取自无机原水培养的厌氧氨氧化UASB反应器，反应器由有机玻璃制造(双层结构，外层水浴)，有效容积为20 L，运行时间接近400 d。反应器进水由未脱氧自来水批式配制(目前单次配制1200 L)，
和
分别控制为(100±10)mg/L和(120±10)mg/L，其余组分及微量元素参考文献[15]。运行过程中，当室温<25 ℃时，通过水浴调节反应器温度为(25±1)℃，当室温>25 ℃时，反应器在室温下运行(夏季室内最高温度<30 ℃)。
图1为批式反应装置示意，其中包含磁力搅拌器、500 mL的玻璃反应瓶(反应有效容积为450 mL)，以及雷磁JPSJ-605溶解氧测定仪和梅特勒-托利多FE20pH计等。
图1 反应装置示意
Fig.1 Schematic diagram of the denitrification reactor
试验步骤：1)污泥准备：即时抽取厌氧氨氧化污泥，用自来水和去离子水分别清洗3次，然后用12目标准筛滤水10 min，最后用天平称取湿污泥60 g用于后续试验；2)泥水混合液准备：应用湿污泥、去离子水、乙酸钠和硝酸钾配制
为50 mg/L的泥水混合液450 mL；3)反应阶段：各批式试验均在敞口玻璃瓶中完成。启动磁力搅拌器，在pH计的辅助下，用1 mol/L的HCl和NaOH维持反应体系的pH为(7.5±0.1)(pH影响试验时则为其他pH点)，沿程测量溶液DO，每间隔一定时间取样2 mL，样品4000 r/min离心后取上清液1 mL用于分析
反应结束：将剩余试验污泥用自来水清洗2次后倒回自养连续流反应器。
纳氏试剂分光光度法；
(1-萘基)-乙二胺分光光度法；
麝香草酚分光光度法；MLSS、MLVSS：重量法；pH、温度：梅特勒-托利多FE20；DO：雷磁JPSJ-605溶解氧测定仪。
样品采集后，冷冻保存4 h后送往上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及分析工作。步骤包括：1)PCR：采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系，采用16S RNA基因V3-V4区通用引物，引物序列为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHV GGGTWTCTAAT，产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量；2)Miseq文库构建和Miseq测序平台测序；3)生物信息分析。
批式试验在2016年夏季7—8月进行，室温28～29 ℃，此时厌氧氨氧化UASB反应器HRT为2 h, 出水ρ(NH3-N)和均<10 mg/L，TN去除率>80%，系统去除能力为2.0～2.2 kg/(m3·d)，随后采集污泥进行高通量测序。高通量测序共获得31113个片段，片段平均长度为444.07 bp。在Usearch(vsesion 7.1)平台按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU cluster，获得27837个有效片段和99个OUT，所有OTU分属49个属和16个门。
样品群落结构组成如图2所示，从细菌门类看，变形菌、绿弯菌和浮霉菌为样品中的优势门类。从整个菌落结构看，优势种群顺序为红环菌>厌氧氨氧化菌Candidatus Brocadia>厌氧绳菌>从毛单胞菌，占比分别为24.22%、21.97%、20.61%和12.72%。从浮霉菌门细菌的测序结果看，6240个片段分属于7个OTU,1个OTU 5个片段确定为属于浮霉菌门，4个OTU 120个片段可确定为属于Phycisphaeraceae科，2个OTU 6115个片段属于Candidatus Brocadia科(其中1个OTU 5182个片段与Candidatus Brocadia fulgida(DQ459989)的相似性为98%，1个OTU 933个片段与Candidatus Brocadia caroliniensis(JF487828)的相似性为98%。那么，Candidatus Brocadia fulgida和Candidatus Brocadia caroliniensis为系统内的主要厌氧氨氧化菌，丰度分别占总菌的18.61%和3.35%,占浮霉菌的83.04%和14.95%。
图2 污泥样品群落结构组成
Fig.2 Microbial community structure of the sludge
各因素批式试验均在敞口玻璃瓶内完成，由于液面和空气直接接触，尤其是在搅拌作用下，空气中的氧易于转移到液相主体。反应体系内存在以下2个过程：1)耗氧异养菌利用乙酸钠为碳源消耗溶液中以及从液面迁移进来的DO，为反硝化过程营造缺氧环境；2)反硝化细菌利用乙酸钠为碳源将
转化为N2(体系内无
和NH3-N积累，浓度均<1 mg/L，后续批式试验结果一致，数据未列出)。
氧是单级脱氮体系的关键因素[11,13,16]。短程硝化、异养反硝化和厌氧氨氧化活性均受氧浓度控制。污泥投量对反硝化的影响如图3所示。可知：当污泥投量为100，80，60 g时，由于所配溶液DO饱和，各污泥投量均在前10 min出现反硝化膝，细菌反硝化活性受到DO的限制。随着液相主体DO被消耗以及后续的液面富氧速率不及耗氧细菌的耗氧速率，10 min后，液相主体
反硝化呈零级反应，污泥投量越大，反硝化越快，高污泥投量未对细菌获取底物产生影响，体系的反硝化能力仅取决于菌量。
—100 g；
—80 g；
—60 g；
—40 g；
—20 g。
图3 污泥投量对反硝化的影响
Fig.3 Effects of sludge dosage on the heterotrophic denitrification
不同于前述3个污泥投量，污泥投量为40，20 g时，DO消耗成为限制性步骤，严重抑制了污泥的反硝化活性。污泥投量为40 g时，反应50 min后浓度才开始下降，污泥投量为20 g时，反应时间接近100 min时仍未观察到浓度的显著下降。图4为不同污泥投量下各体系DO平均浓度的变化(污泥投量100，80 g时的DO变化类似于60 g，数据未列出)。污泥投量60 g时，初始ρ(DO)平均为1.775 mg/L，15 min时，ρ(DO)平均为0.075 mg/L。污泥投量40 g时，前50 min ρ(DO)>0.12 mg/L，之后≤0.12 mg/L，因此可以认为ρ(DO)=0.12 mg/L为所试污泥的抑制节点，并且氧的抑制作用属于暂时性的。当然，在单级生物膜或者颗粒污泥处理体系中，由于有表层耗氧硝化菌和异养菌的保护，当液相主体ρ(DO)<2.0 m/L时，厌氧氨氧化菌仍可以保持较高的生物活性[8,17]。虽然，由于氧的限制，污泥投量20 g 时未检测出明显的浓度下降，但是在持续的检测过程中发现DO消耗过程满足一级动力学方程，拟合相关系数达到0.9935。
60 g；
40 g；
20 g；
—20 g R2=0.9935。
图4 不同污泥投量时DO的变化
Fig.4 Change of dissolved oxygen during denitrification process under different sludge dosage
批式试验共设置4个乙酸钠投量梯度，分别为6，4，3，2 mmol/L(对应ρ(BOD5)分别为256，170，128，85 mg/L)，在初始为50 mg/L条件下，对应BOD5/N分别为5.1、3.4、2.6和1.7。从理论计算，异养反硝化的BOD5/N值需为2.86，那么，BOD5/N为5.1和3.4时，碳源充足，BOD5/N为2.6时，碳源略不足，BOD5/N为1.7时，碳源严重不足。
在实际废水中有机物普遍存在，因此，碳源种类和数量一直是厌氧氨氧化体系的研究热点[18-20]。BOD5/N对反硝化的影响如图5所示。可知：BOD5/N为5.1、3.4和2.6时异养反硝化均呈零级反应，线性拟合度分别为0.9932，0.9916，0.9912，BOD5/N为5.1时，反硝化速率最快。当BOD5/N为3.4时，反硝化速率为最大反硝化速率的90.5%，当BOD5/N为2.6时，反硝化速率为最大反硝化速率的79.4%。当碳源不足时(BOD5/N为1.7)，反硝化初期速率与BOD5/N为2.6时非常接近，仅在反应后期(120 min后)受到碳源浓度限制。因此，可以认为颗粒污泥内的混合菌群对有机物的亲和力较高，获取有机物的能力较强，即使在低有机物浓度条件下也可利用碳源进行反硝化。
—BOD5/N为5.1；
—BOD5/N为3.4；
—BOD5/N为2.6；
—BOD5/N为1.7。
图5 BOD5/N对反硝化的影响
Fig.5 Effect of BOD5/N on heterotrophic denitrification
污泥取出清洗后，用12目和20目标准筛筛分以获得不同粒径的污泥。不同粒径相同质量的厌氧氨氧化颗粒污泥的异养反硝化(图6)符合零级反应，线性拟合度分别为0.9700，0.9855，0.9675。粒径为0.9～1.6 mm时，降解速率最快，粒径>1.6 mm时速率为粒径0.9～1.6 mm时的74.2%，<0.9 mm时速率为粒径0.9～1.6 mm时的65.3%。由于厌氧氨氧化菌生长缓慢，较敏感，其颗粒化过程受多种因素的限制[21，22]，粒径越大，其对环境和底物浓度冲击的耐受能力越强，但由于扩散限制其活性相对减少。粒径越小，其对环境条件和底物浓度冲击的适应性更差，但在适宜条件下，活性相对更高。因此，批式试验结果可从以下2个方面分析：1)小颗粒污泥的反硝化活性易受体系内微量DO的影响；2)大颗粒污泥的反硝化活性易受底物扩散的限制。
—<0.9 mm；—0.9～1.6 mm；—>1.6 mm。
图6 污泥粒径对反硝化的影响
Fig.6 Effect of particle size on heterotrophic denitrification
从1995年开始，厌氧氨氧化技术的研究和开发已接近25年，各类工艺方法已逐渐从实验室走向工业应用。但是，在应用中厌氧氨氧化过程仍然存在一个突出的问题，即厌氧氨氧化反应中除N2外的另一个产物-硝酸盐，按传统的厌氧氨氧化化学计量学方程，其产率为NH3-N削减量的26%。尤其是在高氨氮废水厌氧氨氧化处理工艺中，硝酸盐为处理系统TN达标排放的主要限制因素。因此，本文提出直接利用厌氧氨氧化系统末端进行异养反硝化深度脱氮，其优点主要有：1)避免新建生物反硝化脱氮构筑物，节约构筑物投资成本；2)利用厌氧氨氧化菌异养反硝化脱氮低污泥产率的特征，减少处理系统的污泥产率，节约系统运行成本。从本文研究结果可看出，厌氧氨氧化菌群在外加乙酸钠碳源条件下可有效深度去除硝酸盐，反应过程的关键控制参数为有机物浓度与硝酸盐浓度的比值以及反应体系的DO。但是，在厌氧氨氧化异养反硝化深度处理体系中，厌氧氨氧化反应是否可以持续稳定，厌氧氨氧化菌的增殖是否可得到强化，其他异养反硝化菌是否会发展为优势菌种等问题还有待进一步研究。
本研究以无机基质培养的厌氧氨氧化污泥为对象，研究DO、BOD5/N和粒径3个因素对其反硝化降解活性的影响，主要结论如下：
1)高通量测序结果表明，本次实验使用的厌氧氨氧化颗粒污泥内的厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia fulgida和Candidatus Brocadia caroliniensis，分别占总菌的18.61%和3.35%。
2)高浓度氧能完全抑制厌氧氨氧化污泥的异养反硝化活性，当液相主体ρ(DO)<0.12 mg/L时，异养反硝化活性最佳。维持较低的DO，有利于厌氧氨氧化污泥充分发挥异养反硝化活性。
3)碳源充足时，厌氧氨氧化污泥的异养反硝化活性受菌种数量限制；碳源不足时，混合菌群也可以充分利用原水碳源进行反硝化。
4)不同粒径厌氧氨氧化颗粒污泥的反硝化速率差异表明，相对于底物扩散，微量氧对厌氧氨氧化污泥反硝化的限制更大。
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Abstract: In this paper, anaerobic ammonia-oxidized sludge cultured in inorganic substrates was focused to study the effects of sludge dosage, DO, BOD5/N, and particle size on denitrification activity.First, the population structure of the bacteria was obtained by high-throughput sequencing technology, which was found to include anaerobic ammonia-oxidizing bacteria Candidatus Brocadia fulgida and Candidatus Brocadia caroliniensis.The results of batch experiments showed that: DO was the most important limiting factor for heterotrophic denitrification in anaerobic ammonium oxidation sludge.DO concentration of 0.12 mg/L was the limit for denitrification reaction.The effect of carbon source concentration to the denitrification of anammox sludge was quite limited.With sufficient carbon source, the heterotrophic denitrification activity of anammox sludge was limited by the number of bacteria.When the carbon source was insufficient, the mixed flora could fully utilize the raw water carbon source for denitrification.Compared with the substrate diffusion in the particle, the limitation from trace oxygen to the denitrification of anammox ammonia sludge was more powerful.