0 引 言
铜是参与生物机体细胞代谢的重要元素[1]，过量的铜对水生生物产生毒性[2-4]。我国已颁布的关于铜的GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中，Ⅰ类水质铜的标准为0.01 mg/L，Ⅱ～Ⅵ类水质铜的标准为1 mg/L[5]，GB 11607—1989《渔业水质标准》为0.01 mg/L[6]，这些标准对我国水生态环境保护意义重大。但是随着我国经济社会的进一步发展，特别是为控制藻类水华、鱼类养殖而使用的CuSO4及含铜工业废水等大量排放[7]，使得铜成为水生态环境中对水生生物潜在风险最大的重金属元素之一[3, 8-10]。本研究对我国铜的水质标准修订、保护水生态系统的稳定性具有重要意义。
硬度是影响铜对水生生物毒性的重要水质参数之一[11-14]。我国幅员辽阔，各地区水体硬度相差巨大，全国总硬度<150 mg/L的软水和极软水面积占总面积的42%，150～300 mg/L的适度硬水占34%[15]。另外，同地区时间不同，硬度也不同，如北京密云库区1991—2011年硬度为30.3～446 mg/L[16]。考虑我国本土区域性水环境特征，研究硬度对生物急性毒性的影响，有利于推动我国水环境质量标准修订。
斑马鱼原产于印度、孟加拉等热带地区溪流，在我国各实验室广泛用于毒性测试[17-19]，是研究水生生物水质基准良好的模式生物之一[20]。已有研究将斑马鱼分为幼鱼、成鱼阶段进行毒性实验[21]，本研究在该基础上将斑马鱼不同阶段进一步细分，详细了解其变化规律；旨在探索不同生长阶段斑马鱼对污染物铜敏感性差异的变化规律及硬度的影响，以期为铜的生态风险评估及水质基准提供理论依据。
1 实验部分
1.1 实验材料
五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)购于上海国药试剂厂，优级纯；铜标准溶液购于国家标准物质网；二水氯化钙(CaCl2·2H2O)、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钾(KCl)等试剂购于国药集团，分析纯。
AB系斑马鱼(Danio rerio)购自中科院水生生物研究所，并在实验室自行繁殖。
1.2 仪器设备
电感耦合等离子发射质谱(ICP-MS，Agilent7500a，美国)；YSI多参数水质分析仪(YSI；YSI Professional Plus，美国)；人工智能气候箱(MGC-350HP-2，上海一恒科学仪器有限公司)；流水养殖系统(CASA，无锡中科水质环境技术有限公司)。
1.3 实验设计
不同生长阶段包括斑马鱼仔鱼(孵化后1，10，17 d)、幼鱼(孵化后24，31，60 d)和成鱼(孵化后90，120 d)等阶段。硬度范围包括标准毒性试验推荐的标准水(250 mg/L)，代表性选取的软水(50 mg/L)和中硬水(125 mg/L)。
1.4 实验方法
斑马鱼培养参照斑马鱼培养手册和GB 21807—2008《化学品 鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验》[22, 23]，温度为(25±1)℃，光强为1000 lux，光照条件为光照∶黑暗=16 h∶8 h。急性毒性实验参照GB/T 13267—91《水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》[24]和OECD 203 Guideline for Testing of Chemicals Fish Acute Toxicity Test[25]，暴露实验采用超纯水配制的重组水，不同硬度的重组水通过改变水中Ca2+和Mg2+的浓度来实现。重组水配好后曝气24 h，使用时需ρ(DO)>6 mg/L，pH 值稳定在7.8±0.2。每个暴露液浓度设置3个平行，每个平行放入10尾斑马鱼，每24 h更换1次暴露液，并对暴露液中铜浓度取水样实测。观察记录24，48，72，96 h斑马鱼死亡的数目 (用玻璃棒轻触鱼的尾部, 没有反应即认为已死亡)，及时清出死鱼。试验过程中，空白组死亡率低于10%。
表1 不同水体硬度条件下浓度设置
Table 1 Configuration of Cu2+ concentration under different water hardness
硬度/(mg·L-1)鱼龄/dρ(Cu2+)/(mg·L-1)50(软水)1,10,17,24,31,60,90,1200,0.05,0.09,0.16,0.29,0.52,0.70,0.94125(中硬水)1,10,17,24,31,60,90,1200,0.05,0.09,0.16,0.29,0.52,0.70,0.94250(标准水)1,10,17,24,31,60,90,1200,0.09,0.16,0.29,0.52,0.70,0.94,1.26
1.5 统计分析
实验所得数据采用SPSS 22.0软件处理，计算24，48，72，96 h的半致死浓度及其95%置信区间，利用一元线性回归分析半致死浓度与硬度的相关性。
2 结果与分析
2.1 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼仔鱼毒性情况
实验选取了孵化后1，10，17 d斑马鱼小鱼作为仔鱼阶段实验用鱼，分别研究了硬度为50，125，250 mg/L的水质条件下，Cu2+对斑马鱼孵化后1，10，17 d 仔鱼阶段急性毒性，采用更能表示毒性数据集中趋势的几何平均方法[26]计算了不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼仔鱼(24，48，72，96 h)-LC50平均值，如图1所示。可知：Cu2+对仔鱼阶段斑马鱼的半数致死浓度随着时间的延长而降低，说明溶液中Cu2+对斑马鱼仔鱼毒性随着时间增加而增大；不同硬度水质条件下，Cu2+对斑马鱼仔鱼毒性随着硬度增加而降低。
硬度：
—50 mg/L；-
--125 mg/L；
…250 mg/L。
图1 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼仔鱼(24，48，72，96 h)-LC50变化
Fig.1 Acute toxicity of copper on the larvae stage of zebrafish: the average and geometric mean values of (24, 48, 72, 96 h)-LC50
2.2 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼幼鱼毒性情况
实验选取了孵化后24，31，60 d的斑马鱼作为幼鱼阶段试验用鱼，分别研究了硬度为50，125，250 mg/L水质条件下，Cu2+对斑马鱼孵化后24，31，60 d幼鱼阶段急性毒性，采用几何平均方法计算不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼仔鱼(24，48，72，96 h)-LC50平均值，如图2所示。
硬度：
—50 mg/L；-
--125 mg/L；
…250 mg/L。
图2 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼幼鱼(24，48，72,96 h)-LC50变化
Fig.2 Acute toxicity of copper on the juvenile stage of zebrafish: the average and geometric mean values of (24, 48, 72, 96 h)-LC50
由图2可知：Cu2+对幼鱼阶段斑马鱼的半数致死浓度随着时间的延长而降低，说明溶液中Cu2+对斑马鱼幼鱼毒性随着时间增加而增大；不同硬度水质条件下，Cu2+对斑马鱼幼鱼毒性随着硬度增加而降低。
2.3 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼成鱼毒性情况
实验选取了孵化后90，120 d斑马鱼作为成鱼阶段实验用鱼，分别研究了硬度为50，125，250 mg/L水质条件下，Cu2+对斑马鱼孵化后90，120 d成鱼阶段急性毒性，采用几何平均方法计算不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼成鱼(24，48，72，96 h)-LC50平均值，如图3所示。
硬度：—50 mg/L；---125 mg/L；…250 mg/L。
图3 不同硬度条件下Cu2+对斑马鱼成鱼(24，48，72，96 h)-LC50变化
Fig.3 Acute toxicity of copper on the adult stage of zebrafish: the average and geometric mean values of (24, 48, 72, 96 h)-LC50
由图3可知：Cu2+对成鱼阶段斑马鱼的半数致死浓度随着时间的延长而降低，说明溶液中Cu2+对斑马鱼成鱼毒性随着时间增加而增大；不同硬度水质条件下Cu2+对斑马鱼成鱼毒性随着硬度增加而降低。
2.4 不同水体硬度与Cu2+对斑马鱼急性毒性的关系
硬度是影响水体重金属对水生生物毒性的重要因素之一，多数重金属对水生生物毒性与硬度有函数关系[27]。根据实验结果，参考USEPA发布的铜、镉对水生生物急性毒性硬度斜率的计算方法[27, 28]，将硬度及各阶段斑马鱼96 h-LC50值对数转换后，利用一元线性回归分析方法，拟合了Cu2+对斑马鱼仔鱼、幼鱼、成鱼及斑马鱼全生命周期急性毒性与水体硬度的关系，结果如表2所示。拟合计算得出：Cu2+对斑马鱼仔鱼、幼鱼、成鱼和斑马鱼全生命周期硬度斜率分别为0.301、0.471、0.279和0.359；相关系数R2分别为0.891、0.949、0.963和0.936，随着斑马鱼生长，急性毒性与水质硬度相关性逐渐增强。铜的主要致毒机理为Cu2+进入细胞质膜，增加质膜的渗透性，造成K+以及其他离子流失[29]及高浓度的Cu2+造成腮损伤[30]，从而导致死亡。目前大部分学者认为构成硬度的Ca2+、Mg2+和Cu2+在细胞膜上存在竞争吸附关系，并提出生物配体模型[31]，所以随着斑马鱼生长发育和调节机制的完善，Cu2对斑马鱼急性毒性与水质硬度相关性逐渐增强。
表2 不同水体硬度条件下Cu2+对不同阶段斑马鱼急性毒性效应影响线性拟合
Table 2 Linear fitting results for acute toxicity of copper of zebrafish in different hardness
重金属受试生物阶段拟合方程R2铜斑马鱼仔鱼ln(96h-LC50)=0.3006lnH-2.28840.8909幼鱼ln(96h-LC50)=0.4713lnH-3.79040.9490成鱼ln(96h-LC50)=0.2788lnH-3.15950.9631全周期ln(96h-LC50)=0.3592lnH-3.06940.9358
注：H为水体硬度(以CaCO3计)，mg/L。
3 讨 论
已有研究表明，水体硬度能降低重金属对水生生物毒性[32, 33]。USEPA将水体硬度作为研究重金属水质基准必须考虑的因素，再分析不同硬度条件下生物毒性数据，利用污染物对水生生物毒性硬度斜率公式，将水质条件转换为同一硬度水平进行比较，科学地比较污染物毒性效应大小并更严谨地推导水质基准阈值。本研究通过求出Cu2+对不同阶段斑马鱼毒性几何平均值，将毒性几何平均值与溶液硬度拟合得到相关线性方程，表明硬度与各阶段毒性几何平均值显著相关(R2>0.90)，在推导其他硬度下Cu2+对各阶段斑马鱼毒性大小时得出的数值可靠。研究得出：Cu2+对斑马鱼全生命周期硬度斜率为0.359，研究数值低于周永欣等[34]研究铜对草鱼、鲢鱼、大鳞副泥鳅等毒性得出的全生命周期硬度斜率0.751～1.021，熊小琴等[14]研究铜对稀有鮈鲫的全生命周期硬度斜率为0.727，以及USEPA[27]制定的铜基准硬度斜率为0.942，与王伟莉等[35]研究得出的0.51更接近。实验结果表明，生物种类以及不同生命阶段均影响污染物基准硬度斜率，研究水体硬度与重金属生物毒性相关关系，有利于掌握重金属对生物体生物有效性的计算，丰富不同硬度重金属对生物体生物有效性的数据库。
4 结 论
1)同等水质条件下，Cu2+对斑马鱼不同生长阶段毒性顺序为：成鱼>幼鱼>仔鱼。
2)通过改变水体硬度，影响Cu2+对斑马鱼各生长阶段急性毒性，Cu2+对斑马鱼仔鱼、幼鱼、成鱼和全生命周期96 h-LC50与水质硬度线性呈负相关，相关系数分别为0.891、0.949、0.963和0.936。硬度为50，125，250 mg/L条件下，96 h-LC50几何平均值分别为0.20，0.24，0.35 mg/L。
3)通过实验计算得出，Cu2+对斑马鱼仔鱼、幼鱼、成鱼和全生命周期平均急性毒性与水体硬度对数拟合计算得到硬度斜率分别为0.301、0.471、0.279和0.359，丰富了硬度对重金属生物体生物有效性的数据库。
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