0 引 言
目前利用微生物将有机废物转化为高附加值羧酸盐的技术日趋成熟[1]，其中乙酸、丙酸及其他短链脂肪酸(SCFA)是最常见的终产物[2]。然而产物SCFA几乎完全溶于水，难以提取，因此利用SCFA来合成中链脂肪酸(MCFA)越来越受到关注。己酸又名羊油酸，属于MCFA终产物之一，分子式为C6H12O2。与SCFA相比，己酸拥有较长的疏水性碳链，故其溶解度较低，仅为10.82 g/L[3, 4]，更易于从发酵液中选择性分离；此外，与短链醇基化合物相比，己酸分离提纯较乙醇蒸馏消耗更少的能量[5]；从能量角度，己酸分子中O/C值更低因而能量密度更高，是更有利的高附加值产品[3, 6]。
己酸虽然不能作为燃料直接使用，但可用作生产液体燃料的前体[6-9]。己酸也是合成化学制品的前体[6, 10]，如食品添加剂[11]、动物饲料添加剂和己基酯[12, 13]。此外，己酸还可用于生产农业“绿色”抗生素[14]、抑菌剂[5, 15]、防腐剂[7]、润滑剂[16]、染料、橡胶，以及生物可降解塑料[17]。目前己酸工业生产以石油化工行业为主，但这些生产方法能耗高、污染严重，因此寻找环保又经济的己酸生产工艺是亟待解决的问题。近年来，利用废弃生物质厌氧发酵合成己酸越来越受到国内外学者的关注，生物法己酸合成也逐渐成为目前己酸生产的主流方法之一[5, 18～22]。
本文针对厌氧发酵生产己酸这一研究领域，首先针对乙醇、乙酸分别作为电子受体、供体的情况，阐述生物己酸的合成机理和代谢途径，并总结目前研究报道能够用于己酸合成的电子供体和受体的有机底物；最后针对影响己酸生物合成的因素进行阐述，总结了各因素的优化条件及其实现方法。
1 己酸菌代谢途径
目前已报道的己酸合成微生物共有5种，均为严格厌氧菌。其中，针对科氏梭菌(Clostridium kluyveri)的研究最多，应用最广。此外，针对开放式发酵产己酸系统，其接种物的菌群结构中，也主要为科氏梭菌，这是由于科氏梭菌的pH值适应范围较广(pH为5.2～8.0)，且产孢子、耐高温[23]。
科氏梭菌不能代谢糖类物质，而是利用乙醇、乙酸合成己酸。Barker等[24]利用同位素标记底物中的乙酸与未标记的乙醇发酵，发现产物己酸中的同位素含量为初始底物中的1/3，且最终产物中乙酸的同位素含量低于初始底物，又利用同位素标记底物中的丁酸与未标记的乙醇发酵，发现产物中的己酸含同位素而乙酸不含，表明己酸中的碳原子来源于乙醇、乙酸或乙醇、丁酸，新生成的乙酸来源于底物中的乙醇。
目前，关于生物合成己酸的代谢途径，如下观点得到普遍的认同：己酸合成过程中，微生物的代谢途径为羧酸链的延长过程即逆β氧化反应，该过程需要电子供体和受体，最常见的供体和受体分别为乙醇和乙酸。己酸的微生物合成代谢途径如图1所示，首先乙醇在乙醇脱氢酶(Adh)和乙醛脱氢酶(Ald)的催化作用下氧化为乙酰CoA，乙醛是中间产物(表1反应式1—3)。一部分乙酰CoA与乙酰辅CoA缩合为丁酰CoA，丁酰CoA与乙酸在乙酰CoA转移酶(Cat3)的催化作用下反应生成丁酸和乙酰CoA(表1反应式4)，即1分子乙醇与1分子乙酸反应生成丁酸(表1反应式5)。另一部分乙酰CoA与丁酰辅酶A缩合为己酰CoA，己酰CoA与丁酸反应生成己酸(表1反应式6)，即为1分子乙醇与1分子丁酸反应生成己酸(表1反应式7)，综合以上所有反应，即为2分子乙醇与1分子乙酸反应生成1分子己酸(表1反应式8)[25]。
图1 己酸合成代谢路径
Figure 1 Metabolic pathways of caproic acid biosynthesis
表1 己酸合成代谢反应机理
Table 1 Metallic reaction mechanism of caproic acid biosynthesis
编号反应式文献1C2H5OH + 2NAD+ → Acetyldehye-CoA +(NADH+H+)[25]2Acetyldehye + NAD+ + CoA → Acetyl-CoA +(NADH+H+)[25]3C2H5OH +2NAD+ + CoA → Acetyl-CoA + 2(NADH+H+)[25]4Butyryl-CoA + C2H4O2→ C4H8O2 + Acetyl-CoA[25]5C2H5OH +C2H4O2 → C4H8O2 + H2O[1, 25, 26]6Caproyl-CoA + C4H8O2 → C6H12O2 + Butyryl-CoA[25]7C2H5OH + C4H8O2 → C6H12O2 + H2O[1, 25, 26]82C2H5OH + C2H4O2 → C6H12O2 + 2H2O[1, 25, 26]9C3H6O3 + H2O →C2H4O2 + 2H2 + CO2[20]10C3H6O3 + C2H4O2 + H+ →C4H8O2 + H2O + CO2[20]11C3H6O3 + C4H8O2 + H+ →C6H12O2 + H2O + CO2[20]123 C3H6O3 +2H+ → C6H12O2 + 2H2 + H2O + CO2[20]
2 产己酸发酵的底物
2.1 电子供体
2.1.1 乙 醇
乙醇作为电子供体被广泛用于己酸合成。通常底物中碳源浓度越高，己酸产量越大。但研究发现，若乙醇浓度超过700 mmol/L(32 g/L)，科氏梭菌的生长将受到抑制，己酸浓度降低[6]；当乙醇浓度超过40 g/L，己酸合成完全被抑制[27]。
2.1.2 氢 气
Steinbusch等[28]利用氢气还原乙酸制乙醇时发现产物中含有己酸，但含量极低(0.03 g/L)。随后Steinbusch等[3]研究证明氢气可作为电子供体用于己酸合成，反应见式(1)：
C2H3O2-+ H+ + 2H2 → C2H6O + H2O
(1)
乙酸被氢气还原为乙醇，生成的乙醇与乙酸反应合成己酸，但反应式(1)的吉布斯自由能仅为-9.1 kJ/mol，接近0，因此需要较高的氢气分压才能使反应顺利进行[28]。Ding等[25]研究发现，在众多糖类产氢气的反应器中丁酸是主要产物，己酸较少，表明氢气较乙醇产己酸效果差；Steinbusch等[28]的研究结果同样认为乙醇比氢气更适宜作为电子供体。
2.1.3 乳 酸
Kucek等[29]以乳酸为碳源合成己酸，首次实现利用乳酸向己酸的连续转化。Zhu等[20]利用黄水合成己酸，证明乳酸可以作为碳源和电子供体用于己酸的合成，然而目前乳酸合成己酸的代谢路径尚无确切研究结果。Kucek等[29]猜测其反应路径如图1所示：L-乳酸首先在乳酸消旋酶聚的作用下合成D-乳酸，然后D-乳酸在D-乳酸脱氢酶(iD-LDH)的作用下转化为丙酮酸，丙酮酸继续转化为乙酰CoA和CO2，一部分乙酰CoA生成乙酸并提供ATP(表1反应式9)，另一部分乙酰CoA进入经由逆β氧化反应生成己酸(表1反应式10)。
研究发现：初始乳酸浓度过高，最终主产物不再是己酸而是丙酸，此后即使降低乳酸浓度，也未观察到己酸积累。对于这一现象，Kucek等[29]认为：当初始乳酸过多时，乳酸转化为乳酰CoA，继而转化为丙酰CoA最终生成丙酸。且一旦L-乳酸盐浓度累积并诱导乳酰CoA形成，可能很难将乳酸导向丙酮酸和偶数链延伸产物(如正己酸)，因此控制乳酸初始浓度对于乳酸合成己酸的反应十分重要。
2.2 电子受体
2.2.1 乙酸、丁酸
乙酸是己酸合成反应中常用的电子受体[2,3,6,18,23,30,31]，对于部分己酸菌，乙酸、丁酸的添加不是必要的，当添加乙酸、丁酸供己酸菌利用时，观察到己酸浓度的升高或降低。例如，Byoung等[32]在培养基内添加乙酸后发现，己酸浓度从0.98 g/L提高至2.99 g/L；而利用葡萄糖作碳源时，添加6 mmol/L乙酸可促进Megasphaera elsdenii NIAH-1102生长，但己酸浓度从11.5 g/L降低至7 g/L[33]。与对照发酵组(仅提供乳酸盐为碳源)相比，乙酸或丁酸的添加使己酸合成的初始延滞期从24 h缩短至12 h，表明乙酸和丁酸可以加速己酸的合成[34]。
2.2.2 丁二酸
Kenealy等[35]探索了可供科氏梭菌生长的底物，研究发现丁二酸能够代替乙酸单独作为电子受体生产己酸，即1分子丁二酸可以分裂产生2分子乙酸。但丁二酸却没有普遍被用于己酸生产，因为该反应需要提供足够的还原当量用于丁二酸向乙酸的生物代谢转化，导致电子供体乙醇的消耗量增加，具体反应见式(2)：
乙醇+2丁二酸+H2O→5乙酸+H+
(2)
3 影响因素
3.1 pH值、CO2
pH值对己酸菌的生长有直接影响。研究表明，中性条件有利于合成己酸。科氏梭菌能够在pH值为5.2～8.0内生长，最佳pH值6.8接近中性[35]，在此条件下合成己酸浓度高于弱酸性条件[5, 10, 35]。pH值为5.5时，若未解离的己酸浓度超过0.79 g/L，会显著抑制己酸菌生命活动[36]；当pH>7时，科氏梭菌的生长将受到很大程度的抑制。Steinbusch等[3]在不同pH条件下合成己酸，当pH值为7时，产物中己酸浓度为8.27 g/L，辛酸浓度为0.318 g/L；而pH值为5.5时己酸仅0.12 g/L，无辛酸生成。
关于碱性条件不利于科氏梭菌生长，Tomlinson等[37]采用同位素标记的方式探究科氏梭菌自身细胞内碳原子的来源，研究发现蛋白质的氨基酸的合成主要有2种方式：1)乙酸的不显著副反应(主反应为逆β氧化反应)；2)利用CO2合成氨基酸，其中25%以上的胞内碳来自CO2，仅11%来自乙酸。科氏梭菌生长速率通常与被固定的CO2量相关，故认为科氏梭菌的生长速率取决于能够利用的CO2浓度。科氏梭菌利用CO2合成蛋白质的速率要高于利用HCO3-的速率，当pH值>7.0时，碳酸盐中仅不到10%以CO2分子的形式存在，当pH值<6.3时，50%以上碳酸盐以CO2形式存在，所以碱性条件将导致CO2的减少，蛋白质合成受阻，不利于科氏梭菌生长[2]。
此外，虽然发酵初始pH值易于调控，但随着己酸生成，pH值不断下降，直接影响己酸菌的生命活动。同时，pH值降低间接影响己酸的合成，即pH值降低导致己酸抑制纤维素水解的效果增大(负反馈)[10]，pH值影响乙酸还原为乙醇的反应，导致乙醇浓度的改变，进而影响合成己酸浓度[28]。目前研究表明，pH值可以从不同方面影响己酸的合成，即低pH值(5.5以下)不利于产己酸菌的生长及己酸合成。
3.2 温 度
温度是微生物生长的重要条件之一，己酸菌只有在适宜的温度下才能表现较高的活性。最初，Agler等[22]设定发酵温度为55 ℃，并通过在线萃取的方式降低己酸的毒性，发现己酸菌并没有催化己酸合成反应的进行，而是富集在萃取系统中，表现出很高的活性。随后，将反应器温度逐渐降低至30 ℃，发现反应器内己酸浓度迅速显著增加。多数己酸菌表现为嗜温性，可在30～40 ℃内生长，如科氏梭菌能够在19～37 ℃内生长，最佳温度为34 ℃[23]。
3.3 水力停留时间
水力停留时间(HRT)通过2个途径对微生物己酸合成产生影响：首先，控制HRT可控制混合发酵菌群结构，即减少产甲烷菌等不利于可合成己酸的微生物在反应器中的积累，从而减少底物的竞争性损失，从而提高己酸产量。减小HRT是抑制产甲烷菌的主要手段之一，即HRT的减小使得产甲烷菌在达到对数期前从反应器内流失而无法在反应器内富集，限制乙酸营养型产甲烷菌的生长，从而减少乙酸的消耗。其次，控制HRT的适量减小，可以降低反应器内的己酸浓度，从而减小其对微生物的毒性，最终增大己酸的合成速率。Grootscholten等[31]将HRT从16 h降至4 h，MCFA合成速率从19.3 g/(L·d)提高至57.4 g/(L·d)。
值得注意的是，减小HRT同样会影响己酸菌的正常生长。Grootscholten等[2, 5]设定HRT为17 h，因科氏梭菌的最大生长速率>0.1 h-1，故17 h的水力停留时间足以保证科氏梭菌的良好生长，且对产甲烷菌产生抑制，第80天菌群中产甲烷菌的比例<0.1%。Werner等[38]同样设定水力停留时间为17 h，将最大生长速率为0.013 h-1的乙酸营养型产甲烷菌从反应器内溢流脱离。Grootscholten等[31]将HRT从16 h 降至4 h，产物中己酸浓度由最高12 g/L降至9.3 g/L，限制了乙酸营养型产甲烷菌，MCFA选择率>80%。以上研究表明，降低HRT抑制乙酸营养型产甲烷菌，促进合成己酸的方法是可行的。
3.4 竞争路径
控制竞争路径是建立高效产己酸发酵系统的前提，目前已知的竞争路径有如下3种[5]：1)甲烷合成；2)过量乙醇氧化为乙酸；3)MCFA氧化为乙酸。其中，1)和2)主要存在于混合微生物的开放式发酵模式，3)则普遍存在于己酸的发酵，反应式如表2所示。
表2 竞争路径的关键反应
Table 2 Key reactions of competitive pathways
编号反应式过程1C2H4O2+ H2O → CH4 + CO2乙酸氧化途径产甲烷23H2 + CO2 → CH4 + 2H2O氢气营养型产甲烷3CxH2x+1COOH + 2H2O → C(x-2)H2(x-2)+1COOH + 2H2中链脂肪酸的氧化
在大多数乙醇、乙酸合成己酸的开放式发酵中，甲烷的合成是最常见的竞争途径，对于乙酸营养型产甲烷菌其主要代谢底物为乙酸，即与己酸合成的逆β氧化反应竞争乙酸，导致能够用于合成己酸的电子受体的减少(见表2反应式1)。此外，乙酸营养型产甲烷菌在合成甲烷的过程中，还伴随着CO2的生成，CO2浓度的增高导致氢气分压的下降，从而使得更多的乙醇氧化为乙酸，造成电子供体减少，从而抑制己酸合成。另外，氢营养型产甲烷菌虽然可以利用反应器内的氢气、CO2合成甲烷(表2反应式2)，但由于其并未代谢用于合成己酸的底物(乙醇、乙酸及中链脂肪酸)，且CO2浓度随着甲烷的合成不断下降，并且无法得到补充，氢营养型甲烷合成无法持续进行，故在此不认为该反应是竞争路径[5]。
目前常见的抑制产甲烷菌的方法有[22]：1)加入抑菌剂，如BES；2)调节pH值；3)高温灭菌；4)减小HRT。其中，调节pH值、HRT不仅抑制甲烷合成，同样会影响己酸菌的生命活动。抑菌剂虽然可以很好地抑制产甲烷菌，但价格昂贵，通常需要持续加入，导致成本增加，常见抑菌剂包括碘仿[39]和BES[3]。高温抑菌适用于具有孢子结构的己酸菌，如科氏梭菌，Barker等[23]在筛选科氏梭菌时对分离、富集培养基在80 ℃下加热15 min可杀死Methanobacterium omelianskii。
“过量”特指除己酸菌外的微生物氧化乙醇的过程，其导致乙醇的额外消耗，最终己酸浓度的降低，通常采用增大H2分压的方式限制“过量”乙醇的氧化[5]。己酸(中链脂肪酸)氧化为乙酸的过程使最终己酸浓度低于最初的期望值，该过程也被称作β氧化反应(表2反应式3)。
3.5 H2分压
H2作为逆β反应的电子供体，H2分压自然影响己酸的合成。研究表明，高H2分压有利于VFA作为电子受体参与己酸的合成[3]。丁二酸与乙醇作为底物用于合成己酸时，H2分压直接影响底物消耗速率，当底物中乙醇过量时，乙酸主要来自乙醇氧化；当添加少量乙醇时，乙酸主要来自丁二酸的转化，1分子乙醇消耗的同时2分子丁二酸转化为4分子乙酸，但乙醇消耗减少的同时其提供的还原当量相应减少，成为反应的最大限制。此时H2分压增大可以弥补还原当量的不足，继续与丁二酸反应生产己酸，为了减少乙醇的消耗，通常添加少量乙醇，增大H2分压，与丁二酸反应生产己酸[35]。
过量乙醇氧化为乙酸的竞争路径受到H2分压的影响。Grootscholten等[5]通过降低CO2的方法间接提高H2分压，发现乙醇浓度升高，乙酸浓度降低，因为高H2分压使得乙醇氧化反应在热力学上不可行[25]，而己酸菌在高H2分压条件下仍然可以氧化乙醇为自身提供能量，重新利用己酸合成过程中乙醇氧化释放的电子[5]。
脂肪酸的氧化只有在H2分压<10 Pa的条件下发生[5]，如乙酸14.7 Pa、丁酸0.67 Pa、己酸0.26 Pa，故高H2分压同样有利于防止脂肪酸的氧化[19]。
3.6 底物比例
研究发现，己酸浓度与底物中乙醇、乙酸比例有关。表3总结了在不同乙醇、乙酸摩尔比下产物中己酸与丁酸的摩尔比。研究发现，当底物中乙醇过量时，主产物为己酸；随着乙醇比例减小，产物中丁酸比例不断提高；当乙酸过量时，丁酸浓度大于己酸，成为主要产物[30, 35, 50]。Steinbusch等[3]的研究中n(乙醇)∶n(乙酸)为最低值时，其结果与上述观点一致，丁酸为主要产物且无辛酸生成。研究表明，n(乙醇)∶n(乙酸)为3∶7时己酸浓度<1 g/L，己酸浓度随着n(乙醇)∶n(乙酸)的增大而增大，当n(乙醇)∶n(乙酸)为7∶3时，己酸浓度达到最大值3.11 g/L，当这个比例更大时乙醇提供的电子供体过剩，己酸浓度不再增大，己酸菌数量减少[6]。因为丁酸是己酸合成反应的中间产物(表1反应7)，丁酸与乙醇反应能够合成己酸，此时若没有足够乙醇，则己酸的合成反应将不能顺利进行，导致丁酸不断积累[30]。
表3 不同乙醇/乙酸底物条件下的产物中己酸/丁酸的摩尔比
Table 3 Various ethanol/acetic acid ratios in substrates resulted in different caproic/butyric acids ratios in product
底物产物n(乙醇)∶n(乙酸)n(己酸)∶n(丁酸)文献0.230.72[30]0.251.20[6]0.421.40[6]0.761.89[30]1.001.88[6]2.333.00[6]3.355.26[30]4.004.20[6]
3.7 氮 源
微生物的生长离不开氮源，对于己酸发酵实验，目前普遍采用酵母浸粉以提供氮源，通常添加更多的酵母浸粉以获得更高的产物己酸含量。Vasudevan等[18]将酵母浸粉的浓度从1 g/L提高至2 g/L，MCFA合成速率从27.3 g/(L·d)增大至35.7 g/(L·d)，但是酵母浸粉成本较高，寻找减少并代替酵母浸粉的研究，以减少己酸合成成本是将来的研究方向。Bornstein等[30]提出生物素和对氨基苯甲酸能完全代替酵母作为氮源。
综上，中温且中性条件有利于己酸菌生长，磷酸钾或丁酸可作为缓冲剂用于维持发酵体系pH值稳定，低pH值(5.5以下)可实现产甲烷菌抑制的同时促进合成己酸，常用于第1阶段产酸的己酸发酵合成体系。升高发酵体系中CO2浓度，己酸合成速率增大，H2分压减小，导致过量乙醇氧化为乙酸，己酸合成受抑制。减小反应器HRT，能够抑制乙酸型产甲烷菌，己酸合成速率大，浓度降低。添加抑菌剂与高温灭菌虽然抑菌效果好，但价格昂贵成本高。科氏梭菌利用乙醇、乙酸合成己酸时最佳摩尔比为7∶3。目前需要着重于减小己酸合成底物中氮源酵母浸粉的成本，使生物己酸合成更加经济。
4 结论和展望
乙醇作为电子供体合成己酸的机理已有十分成熟的理论体系，而乳酸作为电子受体合成己酸近年研究处于初始阶段，部分报道提出乳酸作为电子供体合成己酸的机理，但尚未得到证实，分析乳酸合成己酸的机理，寻找其他利用乳酸的己酸合成菌值得更多学者深入研究，或可成为未来的发展方向。影响己酸合成的因素目前研究报道较全面。己酸菌适宜在pH=6.8，37 ℃条件下生长。产甲烷反应是乙酸合成反应的主要竞争途径，降低pH、减小HRT、加入抑菌剂、高温灭菌是常见手段。增大H2分压可以防止产物己酸的氧化。电子受体、供体摩尔比为3.0左右时己酸产量较高，但其内在机制机理仍需进一步的研究来解释。此外，氮源是影响己酸菌生长的关键因素之一，而现阶段生物合成己酸普遍采用酵母浸粉提供氮源，其成本较高，需要寻找其他代替物。
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