0 引 言
随着工农业、城市化不断发展以及国家产业的调整，土壤重金属污染现象非常严重，出现了各类重金属复合污染场地，对当地的生态环境造成了严重威胁[1]。内蒙古包头市某尾矿库始建于20世纪60年代，含有各类重金属元素、稀土元素及选矿残留的酸性离子，属于典型的重金属复合污染场地。大量的重金属复合污染物随着尾矿库渗漏水、地表径流和扬尘等在该湿地中不断累积，导致重金属复合污染物的含量度逐年增加，形成了一个极具危险性的污染源[2,3]。已有研究表明，该尾矿库周边的地下水和土壤均受到不同程度的污染[4,5]，复合污染对玉米和泥鳅造成遗传损伤[6]。
在尾矿库及周边区域内生存着大量的花背蟾蜍，由于花背蟾蜍特殊的生理结构和独特的生活周期[7-9]，是生态环境监测的优良指示物种[10,11]。已有相关报道表明，重金属污染会影响花背蟾蜍的跳跃能力和骨骼分化[12,13]，通过对蝌蚪组织氧化损伤和红细胞DNA损伤影响其胚后发育[11]，导致花背蟾蜍死亡率和畸形率的增加[14]，增加繁殖投入[15,16]，延缓胚胎发育[17,18]。重金属富集能显著影响蝌蚪泳动能力[19,20]，造成蝌蚪畸形率和死亡率升高[21]，影响蝌蚪正常的生长发育，导致种群数量降低[22]。然而，目前关于尾矿库重金属复合污染场地对花背蟾蜍雄性性腺的毒理学效应研究鲜有报道。
本研究以花背蟾蜍为研究对象，以包头市某尾矿库南侧因渗漏水形成的不连续湿地群为研究样地，以小白河黄河湿地自然保护区作为对照样地，通过对比分析2个样地花背蟾蜍的条件因子、脏器系数、精子动态参数、精子畸形率、性激素含量、红细胞微核率和DNA损伤等监测指标，探究尾矿库重金属复合污染场地对花背蟾蜍雄性性腺的毒理学效应，以期为对当地两栖类种群的保护和尾矿库污染的生物监控提供数据支持和理论依据。
1 实验部分
1.1 研究样地
本研究以包头市稀土金属冶选尾矿库南侧受污染的水域湿地为研究样地(简称“尾矿库湿地”)，以相对无污染的小白河黄河地保护区湿地为对照样地(简称“小白河湿地”)。尾矿库始建于1965年，汇集了选矿厂、稀土厂、焦化厂的矿渣、尾矿和废水，占地约达到11 km2，尾矿坝高出地面30 m，地势南低北高，地下水流向由东北流向西南，在尾矿库南侧地势低洼处由渗漏水和地表水形成了一片面积约为1×105 m2的不连续湿地群[23]。尾矿库中由于冶炼残留的重金属和盐离子等通过渗漏和扬尘飘落，大量集聚到其周边湿地水体及底泥中，污染严重。而小白河湿地隶属于包头市黄河段的国家自然保护区，远离工业区、农业区和居住区，污染相对较轻，且人为干扰小。本研究分别在尾矿湿地和小白河湿地内选取面积约为1万m2的水域面积作为实验样地。
图1 研究样地分布
Figure 1 Research sampling sites
1.2 水体和底泥样品采集与处理
参考HJ 25.1—2014《场地环境调查技术导则》、HJ 25.2—2014《场地环境监测技术导则》、HJ 493—2009《水质采样 样品的保存和管理技术规定》、HJ/T 166—2004《土壤环境监测技术规范》、GB 15618—1995《土壤环境质量标准》进行水样、土壤和底泥样品采集、运输、保存与分析。在2个样地分别采集9份水体和底泥。用湿法酸消解预处理样品，稀释后用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)分析重金属元素含量。
1.3 花背蟾蜍的抓捕与生理分析
正式实验在2018年4月初开始，此时花背蟾蜍冬眠结束并且大量外出活动，至7月中旬繁殖活动结束为止。在尾矿库湿地和小白河湿地内各自设置1个样点，样点面积均为10000 m2。分别在2个样地捕捉9只雄性花背蟾蜍，观察花背蟾蜍有无婚垫、体外颜色和鸣叫声来分辨性别。用白色带孔塑料桶将花背蟾蜍带回实验室，用鱼缸养殖待用。用滤纸将花背蟾蜍体外水分吸干，测量花背蟾蜍的体重和体长，计算条件因子(conditional factor)，CF=体重(g)×100/体长(cm)。
用双毁髓法处死花背蟾蜍(6只，每2只1组，做3组平行)，解剖后迅速用一次性真空采血管(抗凝剂)取心脏附近的血液2份。一份装入1 mL离心管中，低温低速离心10 min，1000 r/min，取上层黄色血清用于性激素含量测定；另一份用于测定花背蟾蜍的红细胞微核率(微核试验，micronucleus，MN)和DNA损伤(单细胞凝胶电泳技术，single cell gel eletrophoresis，SCGE)。迅速对精巢进行称量计算脏器系数(精巢脏器系数=精巢质量/体重)，然后将精巢浸泡在0.65%的生理盐水中，用眼科剪刀纵横两刀剪破精巢，使得精子游离出来，快速使用精子质量自动检测系统(CASA)测定精子的动态参数。
1.4 数据处理与分析
实验数据统计结果以Mean±SE表示。采用SPSS 17.0进行数据分析和One-way ANOVE进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 尾矿库湿地和小白河湿地水体和底泥重金属元素含量分析
将尾矿库湿地和小白河湿地的水体和底泥重金属含量分别与GB 3838—2002《地表水环境质量标准》[24]、河套地区土壤背景值[25]和中国土壤背景值[26]进行比较，结果如表1—2所示，尾矿库湿地中底泥和水体重金属含量均显著(P<0.05)高于小白河湿地。尾矿湿地水体中Cr、Ni、Cu、As、Cd、Hg和Pb 均不同程度超出限值，分别是限值的97，64，4.27，108.6，54，600，2倍。
尾矿库湿地底泥中Cr、Cu、Zn、As、Cd、Hg和Pb含量均高于内蒙古河套地区土壤背景值，其中Cu、Zn、As、Cd和Hg分别是河套地区土壤背景值的2，4.7，7，42，55倍。尾矿库的重金属复合污染程度也显著高于小白河(P<0.05)。尾矿库内汇集了选矿厂、稀土厂、焦化厂的矿渣、尾矿和工业废水，含有各类重金属元素、稀土元素及选矿残留的酸性离子，且含量在逐年升高[27]。尾矿库的地势北高南低，早期尾矿库坝体防水设施不完善以及矿渣露天堆放，各类重金属通过渗漏水、地表水和风力作用汇聚积累在湿地水体中，并经过数十年沉降在底泥中，导致底泥重金属含量远高于水体[28]。
表1 尾矿湿地和小白河湿地水体中重金属元素含量
Table 1 Concentration of heavy metals in water of tailing wetland and Xiaobaihe wetland mg/L
样地ω(Cr)ω(Ni)ω(Cu)ω(Zn)ω(As)ω(Cd)ω(Hg)ω(Pb)尾矿库湿地4.85±0.02a1.28±0.02a4.27±0.14a0.32±0.47b5.43±0.04a0.27±0.01a0.06±0.01a0.10±0.01a小白河湿地0.51±0.01b0.57±0.02b0.59±0.03b0.05±0.07b1.10±0.02b0.19±0.00b0.05±0.00a0.10±0.00a水质标准0.050.021.001.000.050.0050.00010.05
注：水质标准为GB 3838—2002。重金属浓度数据以平均数±标准差(n=9)表示；不同字母表示不同样地之间同一重金属浓度差异显著(P<0.05)。下同。
表2 尾矿湿地和小白河湿地底泥中重金属元素含量
Table 2 Concentrations of heavy metals in sediment of tailing wetland and Xiaobaihe wetland mg/kg
样地ω(Cr)ω(Ni)ω(Cu)ω(Zn)ω(As)ω(Cd)ω(Hg)ω(Pb)尾矿库湿地64.36±9.24a17.24±2.69a38.16±8.72a263.31±55.61a72.2±10.79a5.11±0.11a1.67±0.14a24.21±2.92a小白河湿地30.57±3.48b12.27±1.32b16.51±6.39b50.56±7.94b25.27±1.99b4.80±0.02b1.39±0.19a14.22±3.28aHSBV56.6324.5519.3056.009.710.120.0319.02CSBV53.1023.4020.0067.708.200.070.0423.60
注：HSBV为河套地区土壤背景值，CSBV为中国土壤背景值。
2.2 重金属复合污染花背蟾蜍形态学指标的影响
尾矿库湿地中水体和底泥中重金属元素大量累积，这些元素会通过捕食、呼吸和高渗透性的皮肤进入花背蟾蜍体内富集，最终导致花背蟾蜍的各组织器官受到损伤[29]。为了探索重金属污染对花背蟾蜍形态学的影响，对比分析了尾矿库湿地和小白河湿地花背蟾蜍的体重、体长、体宽和条件因子(CF)等指标，结果见表3。尾矿库湿地花背蟾蜍的体重、体长和体宽均高于小白河湿地。CF值一般表示健康状况并形成总健康指数[30]，尾矿库湿地的CF值显著低于黄河湿地，表明尾矿库湿地花背蟾蜍受到了更为严重的污染胁迫，花背蟾蜍在受到重金属污染胁迫时对生存环境恶化的响应，而改变形态学状况，增加体内金属硫蛋白含量，通过金属硫蛋白将重金属进行储存、传递和解毒[31]。此外，在抓捕花背蟾蜍的过程中，发现尾矿库花背蟾蜍的泳动能力和跳跃能力明显弱于小白河湿地，这与冯磊等[12]的研究结果一致。
表3 尾矿湿地和小白河湿地花背蟾蜍形态学和条件因子(CF)分析
Table 3 Morphology and condition factor (CF) analysis results of B. raddei
区域体重/g体长/cm体宽/cmCF尾矿库湿地22.85±3.646.68±0.474.29±0.477.66±1.45b小白河湿地19.02±3.05.75±0.493.34±0.2710.00±1.27a
2.3 重金属复合污染对花背蟾蜍脏器系数的影响
通过精巢的脏器系数对比分析了尾矿库湿地重金属污染对花背蟾蜍雄性生殖器官的毒性效应。脏器系数是器官对毒性污染物的综合响应程度，正常状况下，脏器系数是一个相对恒定的值，当动物受到污染物毒性胁迫时，受到损伤的脏器重量会随之发生变化，脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变[32]。尾矿库湿地中花背蟾蜍的精巢脏器系数(0.002927±0.000259)显著高于黄河花背蟾蜍的精巢脏器系数(0.00147±0.000396)(P<0.01)。表明尾矿库湿地花背蟾蜍的精巢受到重金属复合污染综合毒性的影响远高于小白河样地，从生物监测的角度证实了尾矿库湿地的污染程度。
2.4 重金属复合污染对花背蟾蜍的精子质量的影响
综合分析精子的平均路径速度、精子的鞭打频率、精子的向前运动力、精子的非向前运动力和精子总活力，评价尾矿库湿地和小白河湿地花背蟾蜍精子的动态参数(表4)，以探究重金属复合污染对花背蟾蜍精子动态参数的影响。尾矿库花背蟾蜍精子的平均路径速度与小白河湿地差异不显著。尾矿库花背蟾蜍精子的鞭打频率和非向前运动力显著高于小白河湿地(P<0.05)，这与精子畸形率提高有直接关系，导致原地打转的精子数量增加。然而，小白河花背蟾蜍的精子向前运动力和总活力显著高于(P<0.05)尾矿库湿地，这非常有助于提高受精率。研究表明，诸多重金属元素如汞、铅、镉等均具有生殖毒性。长时间接触这些重金属能够导致睾丸萎缩、阻碍精子生成、导致精子活力下降、畸形精子比例增加以及精子坏死等现象[33]。本研究结果表明，该尾矿库重金属复合污染对花背蟾蜍的精子质量产生了明显的负面影响，导致尾矿库湿地中花背蟾蜍的精子畸形率(6.72‰)显著高于小白河湿地(3.05‰)(P<0.05)。
表4 尾矿库湿地和小白河湿地花背蟾蜍的精子动态参数
Table 4 The sperm dynamic parameters of B. raddei in tailing pond wetland and Xiaobaihe wetland
样地平均路径速度VAP/(μm/s)鞭打频率BCF/Hz向前运动力PR/%非向前运动力NP/%精子总活力PR+NP/%畸形率/‰小白河12.79±1.626.67±0.73b32.36±0.12a5.12±0.04b37.48±0.11a3.05±0.19b尾矿库11.70±1.228.22±1.56a15.76±0.11b12.41±0.09a28.17±0.15b6.72±0.20a
2.5 重金属复合污染花背蟾蜍的性激素的影响
尾矿库湿地花背蟾蜍的雌二醇水平显著低于小白河湿地(P<0.05)(表5)。尾矿库湿地花背蟾蜍的睾酮水平显著高于小白河湿地(P<0.05)。尾矿库湿地花背蟾蜍的促卵泡生成素的水平与小白河湿地无显著差异。性激素在花背蟾蜍的繁殖和求偶过程中具有关键作用[34]，重金属会导致性激素的分泌水平失衡[29]。本研究中尾矿库湿地的花背蟾蜍体内性激素含量与小白河湿地相比出现了明显差异，这与长期受到尾矿库重金属复合污染胁迫致使性激素分泌紊乱有直接关系，也是造成当地花背蟾蜍的精子质量降低的潜在原因之一。
表5 花背的性激素含量
Table 5 The sexual stimulation contents of B. raddei
样地雌二醇/(μg/L)睾酮/(μg/L)促卵泡生成素/(IU/L)尾矿库10.67±1.53b16.10±1.85a0.21±0.02a黄河21.00±2.00a11.08±1.13b0.19±0.02a
2.6 重金属复合污染花背蟾蜍红细胞微核率和DNA损伤的影响
为了研究尾矿库重金属复合污染对花背蟾蜍红细胞基因的毒性影响，对比分析了尾矿库湿地和小白河湿地中花背蟾蜍红细胞的微核率和DNA损伤程度，如表6所示。可知：尾矿库花背蟾蜍红细胞的微核率和DNA损伤程度均显著高于小白河湿地(P<0.05)。长期的重金属胁迫会导致花背蟾蜍体内重金属富集和氧化应激异常，最终会增加红细胞核DNA的损伤程度和遗传物质变化，通常可以利用DNA损伤和微核率来检测。细胞核的损害会改变遗传物质，造成两栖类的致突变性和致癌性[35,36]。
表6 花背蟾蜍红细胞的微核率和DNA损伤程度
Table 6 Micronucleus rates and DNA damage degree of B. raddei
样地微核率/‰DNA损伤/%尾矿库湿地71.6±8.3a26.8±0.89a小白河湿地6.1±2.2b7.4±0.38b
3 结 论
尾矿库湿地污染程度显著高于小白河湿地，其中尾矿库湿地水体中主要重金属污染元素为Cr、Cu、As、Cd和Hg，而尾矿库湿地底泥中主要重金属污染元素为Cu、Zn、As、Cd和Hg。重金属复合污染通过扰乱性激素分泌、增加细胞微核率和DNA损伤程度对花背蟾蜍雄性性腺造成显著的毒害作用，从而降低精子质量，增加生殖细胞畸形率。同时，花背蟾蜍通过提高自身条件因子和生殖腺脏器系数来对抗和缓解复合污染的毒性胁迫。
本研究从DNA等不同生物学水平上探究了重金属复合污染场地对花背蟾蜍雄性性腺的毒性作用效应及其潜在的作用机制，其数据可为重金属复合污染场地中两栖类种群保护和湿地污染的生物监测提供理论和技术支撑。
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