是导致水体原位固氮速率时空差异的主要原因。摘要：为探究北太湖固氮作用，使用乙炔还原法对其水体的原位固氮作用和室内的N、Fe和Mo对鱼腥藻固氮速率的影响进行研究。结果发现：北太湖的年均固氮速率为3.08 ng/(L·h)，并表现出明显的时空变化特征，梅梁湾水区的速率最高(2.75 ng/(L·h))，湖心区速率最低(1.38 ng/(L·h))；固氮速率在夏季最高[6.03 ng/(L·h)],春[1.08 ng/(L·h)]、秋[0.81 ng/(L·h)]次之，冬季最低[6.97×10-5 ng/(L·h)]。进行相关分析发现：鱼腥藻的生长不受N、Fe和Mo影响(P>0.05)；但N是控制鱼腥藻固氮速率的主要因素(P<0.01)，而Fe和Mo含量对鱼腥藻的固氮作用并不产生显著影响(P>0.05)。北太湖水体的原位水温(P<0.01)、DTN(P<0.01)、蓝藻生物量和是导致水体原位固氮速率时空差异的主要原因。
已有研究发现，不论海洋系统、淡水生态系统，还是土壤、沉积物环境中都存在一定强度的生物固氮作用[1-5]。生物固氮强度因生态系统而异，其固定的N在系统TN输入中所占比例相差很大，范围在0～82%[6]。
生物固氮的测定方法通常有15N同位素吸收法、总氮变量法、乙炔还原法等。这些方法各有优劣[1-5,7]：总氮变量法的测量误差大、灵敏度低、准确度较差、实验时间很长；15N同位素吸收法灵敏度要比总氮变量法高40～100倍，但实验时间较长，测定费用昂贵；乙炔还原法具有实验操作简单、方便、耗费便宜，准确度和精度较高，其灵敏度要比15N同位素吸收法高103～104倍，便于野外实验，其应用越来越广泛。此外，不同生态系统影响生物固氮的因素也有所不同，主要影响因素有温度、光照、扰动、氧气、营养盐、微量元素[8]等。
太湖是国务院重点治理的富营养化水域之一[9]。2003年梅梁湾蓝藻大规模暴发，2007年贡湖湾水厂发生严重的水危机事件，使北太湖成为太湖富营养化治理的重中之重。营养物质N是导致太湖富营养化的主要原因之一，现有氮源的计算主要集中在河流输入、面源输入、大气沉降中，但针对北太湖水体生物固氮研究甚少，仅有Mccarthy等[10]于2003年发现太湖湖心区可能存在固氮现象。从北太湖的历年水质监测报告中发现有鱼腥藻(Ananbaena sp.)和束丝藻(Aphanizomenon sp.)等固氮蓝藻的存在。本文以北太湖为研究对象，探究其水体的原位固氮现象和固氮速率的影响因子，以期为北太湖的水质提升提供科学参考。
以北太湖常年水质和蓝藻监测为依据，选取13个点位(系北太湖常规监测点)(图1)在2011年5月—2012年2月期间内每月采取水样，现场用便携式多参数水质分析仪(YSI)测定常规水质参数并设置试验测定水样的固氮速率。
图1 北太湖采样点
Figure 1 The sampling sites of North Taihu Lake
因N元素对蓝藻的固氮速率影响大，而Fe、Mo微量元素对其固氮的影响至今存在争议[11-13]。为检验N、Fe、Mo对蓝藻固氮作用的影响，特选取太湖水体中主要固氮藻鱼腥藻(Anabaena sp.709)[14]为研究对象，以BG11为对照培养液，在BG11培养液中控制Fe、Mo和N等元素设置多组培养液[7,14](表1)对鱼腥藻进行培养，并测定其固氮速率。
表1 不同培养液成分
Table 1 The contents of the different cultures mg/L
成分BG11培养液无N培养液无N、Mo培养液无N、Fe培养液无N、Mo、Fe培养液NaNO31500 0000柠檬酸铁氨60.360.3600Na2MoO4·2H2O0.390.100.10K2HPO44040404040MgSO4·7H2O7575757575CaCl2·2H2O3636363636柠檬酸66666EDTANa211111Na2CO32020202020H3BO32.862.862.862.862.86MnCl2·4H2O1.861.861.861.861.86ZnSO4·7H2O0.220.220.220.220.22CuSO4·5H2O0.080.080.080.080.08Co(NO3)2·6H2O0.050.050.050.050.05
鱼腥藻的培养[15]：按表1配置对照组(BG11培养液)，无N，无N、Mo，无N、Fe，无N、Mo、Fe共5组培养液，每组设3个平行样。所有培养液在灭菌锅中灭菌(121 ℃，40 min)冷却后待用，取一定体积鱼腥藻母液进行离心(4000 r/min，5 ℃，无菌操作)，离心后去除上清液，再加入预接种的培养液再次离心，重复2次，将鱼腥藻接种到灭菌冷却至室温的培养液中(离心和接种全程无菌操作)。接种后的藻溶液安置在光照培养箱(25 ℃，2000 lx)中培养，以3次/d的频率进行摇匀。在设计时间点取一定体积藻液进行固氮速率测定。
固氮速率测定采用乙炔还原法[7]；室内鱼腥藻纯藻的检测除培养条件为室温静止培养外，其他操作与原位方法一致。
等指标的检测方法参照《水和废水监测分析方法》执行；用显微镜法确定鱼腥藻的细胞数。
北太湖各采样点固氮速率分布如图2所示。可知：北太湖水体的固氮速率表现出明显的空间分布特征，调查时间内(2011年5月—次年2月)的最高值出现在梅梁湾的3号点(24.83 ng/(L·h)，夏季)；最低值出现在贡湖湾的13号点(7.79×10-6 ng/(L·h)，图2中右纵轴)。不同季节的固氮速率也存在显著空间分布特点，春季的最大固氮值出现在11号点[6.25 ng/(L·h)]。夏季的最大固氮值出现在3号点[24.83 ng/(L·h)]；秋季的最大固氮值出现在5号点[19.47 ng/(L·h)]；冬季的最大固氮值出现在11号点[2.26×10-4 ng/(L·h)]；而每个季节的最低固氮值接近0，且均分布在不同区域。
平均值；
最大值；
最小值。
图2 北太湖采样点固氮速率
Figure 2 The nitrogen fixation rate of the 13 sites in North Taihu Lake
与同年太湖的平均固氮速率相比，北太湖年均固氮值Anf=3.08 ngN/(L·h)，是全太湖的2倍(全湖年均固氮速率为1.53 ngN/(L·h))[7]，是太湖固氮作用的主要发生区域。
北太湖水体固氮速率存在明显的季节变化特征，如图3所示。可知：北太湖的平均固氮速率在春季为1.08 ng/(L·h)，夏季为6.03 ng/(L·h)，秋季为0.81 ng/(L·h)，冬季为6.97×10-5 ng/(L·h)，表现出夏季最高、春秋季次之、冬季最低的特点。
不同湖区(梅梁湾(1—5号点)，竺山湾(6—8号点)，湖心区(9—11号点)，贡湖湾(12—13号点))也同样表现出极显著的季节特征，同一湖区在不同季节的固氮速率相差可高达104～105倍。梅梁湾水体的固氮速率最大值(8月，13.74 ng/(L·h))是最低值(2月)的105倍；竺山湾水体固氮速率最大值(7月，6.61 ng/(L·h))是最低值(2月)的105倍；贡湖湾水体固氮速率最大值(9月，12.15 ng/(L·h))，而最低值(8月)仅为0 ng/(L·h)；湖心区固氮速率最大值(9月，4.82 ng/(L·h))是最小值(2月)的104倍。
图3 不同湖区的固氮速率
Figure 3 The nitrogen fixation rates in different areas in North Taihu Lake
将水样的固氮速率与对应水质参数进行相关分析，如表2所示。可知：固氮速率与溶解性总氮(DTN)呈极显著负相关(P<0.01)，与水体中的
也呈显著负相关(P<0.05)；与原位水温呈极显著正相关(P<0.01)；与水体中蓝藻生物量呈极显著正相关(P<0.01)。
表2 固氮速率与环境因子相关分析
Table 2 The correlation analysis of the nitrogen fixation rates and the influencing factors of water column
参数DTNNO-3水温蓝藻生物量r-0.26∗∗-0.22∗0.53∗∗0.30∗∗P<0.01<0.05<0.01<0.01
对固氮速率值进行分组绘制散点图(图4)发现：随着溶解性总氮DTN的增加，水样的固氮速率呈指数降低，氮通过抑制固氮酶的合成[10]来控制水体的固氮速率。
图4 固氮速率与DTN和水温散点图
Figure 4 The scatter plot of the nitrogen fixation rate with DTN and temperature
由图4可知：北太湖水体的固氮速率呈现与水温的幂函数关系，温度主要通过改变固氮微生物的新陈代谢和固氮酶的活性来影响固氮作用的强度。整个研究历经4个季节水温差很大(温差高达26.27 ℃)，故原位水温是导致水体固氮速率明显季节特征(夏高冬低)的主要原因[7，16]。
综上分析，水温、固氮蓝藻生物量和营养盐(如
是导致北太湖水体固氮速率时空差异的主要原因。
采用显微镜法对不同时间点的鱼腥藻样品进行细胞总数统计如图5所示。可知：不同培养液的鱼腥藻细胞总数在同一培养时间点基本相同，即不同培养液的鱼腥藻生物量相同，且均随着培养时间的增加而不断增加。
—BG11培养液； 
—无N培养液； 
—无N、Fe培养液； 
—无N、Mo培养液。
图5 不同培养液中生长的鱼腥藻细胞数
Figure 5 The cell numbers of Anabaena grows in different cultures
增设无Fe和无Mo培养液培养试验，检测生物量的同时取第14，20天的鱼腥藻溶液进行固氮速率的检测，结果如图6所示。可知：无氮(无氮，无氮铁，无氮钼，无氮钼铁)培养液系列培养的单个鱼腥藻细胞的固氮速率远大于含氮(BG11，无钼，无铁，无钼、铁)培养液系列培养的鱼腥藻固氮速率，且同一培养液的固氮速率和异形胞占总细胞的比例也随着培养时间的增加而增加。第14天的固氮速率顺序为：无氮铁>无氮钼>无氮>无氮钼铁培养液；第20天的固氮速率顺序为：无氮钼>无氮钼铁>无氮>无氮铁；而2个时间点的含氮培养液中的鱼腥藻均无明显固氮作用。
14 d固氮速率； 
20 d固氮速率； 
—14 d异形胞占比； —20 d异形胞占比。
图6 营养元素对鱼腥藻固氮作用的影响
Figure 6 The effection of the factors on nitrogen fixation rate of Anabaena
由图5可看出：N、Fe、Mo对鱼腥藻生长并不存在显著影响(P>0.05)，这与Allen等[17]固氮蓝藻在无氮培养基中与在
培养基中的生长能力是相等的吻合。
将鱼腥藻的有氮和无氮培养液2个序列进行对比分析(图6)发现：不含氮培养液序列中的鱼腥藻不仅表现出极大的固氮速率，也发现对应的鱼腥藻中异形胞数量明显高于含氮培养液序列。这表明，在好氧条件下，鱼腥藻的固氮作用主要发生在异形胞内[18，19]。在无氮培养液序列内，Fe和Mo的存在与否并不会影响鱼腥藻异形胞的形成(P>0.05)，也不会对鱼腥藻的固氮速率产生显著影响(P>0.05)。这与Bishop等[20]的研究成果吻合。因此，Fe和Mo的存在与否并不会影响北太湖水体中鱼腥藻固氮能力。
1)北太湖水体的年均固氮速率为3.08 ng/(L·h)，且表现出明显的时空变化特征。在空间上，梅梁湾和贡湖湾的固氮速率高于竺山湾和湖心区。在季节上，北太湖在夏季的固氮速率最高，春、秋季次之，而冬季最低。
2)水温(P<0.01)、DTN(P<0.01)、蓝藻生物量(P<0.01)和
是导致北太湖水体原位固氮速率时空差异的主要原因。
3)N是导致鱼腥藻固氮速率差异的主要原因(P<0.01)，而Fe和Mo的存在与否并不影响鱼腥藻的固氮速率(P>0.05)；鱼腥藻的生长不受N、Fe和Mo的影响(P>0.05)。
[1] AHMED A, GAUNS M, KURIAN S, et al. Nitrogen fixation rates in the eastern Arabian Sea[J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2017, 191:74-83.
[2] HOU L J, WANG R, YIN G Y, et al. Nitrogen fixation in the intertidal sediments of the Yangtze Estuary: occurrence and environmental implications[J]. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences, 2018.
[3] BROCKE H J, PILTZ B, HERZ N, et al. Nitrogen fixation and diversity of benthic cyanobacterial mats on coral reefs in Curaçao[J]. Coral Reefs, 2018, 37(3):861-874.
[4] YAO X L, ZHANG L, ZHANG Y L, et al. Nitrogen fixation occurring in sediments: contribution to the nitrogen budget of Lake Taihu, China[J]. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences, 2018,123(9):2661-2674.
[5] LI D J, ZHANG Q S, WANG Z C. Free-living N2 fixation in three karst shrublands, southwest China[J]. Ecosystems, 2019,22:818-826.
[6] HOWARTH R W, MARINO R, LANE J, et al. Nitrogen fixation in freshwater, estuarine and marine ecosystems.1. Rates and importance[J]. Limnology and Oceanography, 1988, 33(4): 669-687.
[7] 张波，张路.太湖水体固氮速率时空变化[J]. 环境科学学报, 2016, 36(4)：1129-1136.
[8] HOWARTH R W, MARINO R, COLE J J. Nitrogen fixation in freshwater, estuarine, and marine ecosystems. 2. Biogeochemical controls[J]. Limnology and Oceanography, 1988, 33(4): 688-701.
[9] QIN B Q，XU P Z，WU Q L，et al. Environmental issues of Lake Taihu，China[J]. Hydrobiologia, 2007, 581：3-14.
[10] MCCARTHY M J，LAVRENTYEV P J，YANG L，et al. Nitrogen dynamics and microbial food web structure during a summer cyanobacterial bloom in a subtropical, shallow, well-mixed, eutrophic lake (Lake Taihu, China) [J]. Hydrobiologia, 2007, 581(1)：195-207.
[11] HIGGINS S N, PATERSON M J, HECKY R E, et al. Biological nitrogen fixation prevents the response of a Eutrophic Lake to reduced loading of nitrogen: evidence from a 46-year whole-lake experiment[J]. Ecosystems, 2018,21:1088-1100.
[12] ESPOSITO R G，WILSON P W. Trace metal requirements of azotobacter[J]. Royal Society of Medicine, 1956, 93(3)：564-567.
[13] ITABASHI T, MORI I, ARASHIBA K, et al. Effect of substituents on molybdenum triiodide complexes bearing PNP-type pincer ligands toward catalytic nitrogen fixation[J]. Dalton Transactions, 2019, 48.
[14] 高良春,张巨源,王莉,等.培养基中几种重要营养元素对Anabaena sp.strain PCC 7120及Synechocystis sp.strain PCC 6803生长的影响[J].华中农业大学学报, 2016, 35(6):17-24.
[15] CASTENHOLZ R W. Culturing methods for cyanobacteria[J].Methods in Enzymology, 1988, 167: 68-93.
[16] HORNE A J. Nitrogen fixation in Clear Lake，California. 4. Diel studies on Aphanizomenon and Anabaena blooms[J]. Limnology and Oceanography, 1979,24(2)：329-341.
[17] ALLEN M B，ARNON D I. Studies on nitrogen-fixing blue-green algae. Ⅰ： growth and nitrogen fixation by Anabaena cylindrica Lemm[J]. Plant Physiology, 1955, 30(4)：366.
[18] HERRERO A，MURO-PASTOR A M，VALLADARES A，et al. Cellular differentiation and the NtcA transcription factor in filamentous cyanobacteria[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2004, 28(4)：469-487.
[19] WOLK C P，ERNST A，ELHAI J. Heterocyst metabolism and development[J]. The Molecular Biology of Cyanobacteria, 2004，1：769-823.
[20] BISHOP P E，PREMAKUMAR R，DEAN D R，et al. Nitrogen fixation by Azotobacter vinelandii strains having deletions in structural genes for nitrogenase[J]. Science, 1986, 232(4746)：92-94.
Abstract: In order to study the nitrogen fixation of the water in North Taihu Lake and the influencing factors, with the acetylene reduction technique(ART)，the nitrogen fixation rate in situ of the water column and the roles of nitrogen (N), iron (Fe) and molybdenum(Mo)in controlling nitrogen fixation rate of Anabaena spp indoor were studied. The results showed that the annual mean nitrogen fixation rate of North Taihu Lake was 3.08 ng/(L·h), with a obvious spatio-temporal variation. The highest rate appeared in Meiliang Bay (2.75 ng/(L·h)) and the lowest rate appeared in the Center of lake (1.38 ng/(L·h)) in space. The rate in summer (6.03 ng/(L·h)) was the highest, and then spring (1.08 ng/(L·h)) and autumn (0.81 ng/(L·h))，lowest in winter (6.97×10-5 ng/(L·h)). With the correlation analysis，the growth of Anabeana spp was not effected by nitrogen, iron and molybdenum (P>0.05). The nitrogen fixation rates were effected by nitrogen (P<0.01), other than iron and molybdenum (P>0.05). Temperature，DTN，the biomass of algae (P<0.01) and (P<0.05) of water in situ were the main influencing factors of the spatio-temporal variation in the in situ nitrogen fixation rates.