0 引 言
石油通常是指未经提炼的原油[1]，具有较强的生物毒性，会通过多种方式造成土壤污染，对人类社会和自然环境构成严重威胁[2]。传统的土壤石油污染治理技术主要是一些物理、化学方法，成本较高且效率低，而原位生物修复是一种高效、经济、可行且环境友好的技术[3]。
石油污染土壤的生物修复中，温度是影响修复效率的重要因素。深层土壤的温度较低[4-5]，适温微生物的生长代谢活动缓慢，降解效率受到限制[6-9]。低温微生物能以独特的生理功能适应环境，用于石油污染土壤修复，不仅技术可行，而且具有重要的理论意义和社会价值。国外已有研究发现了一些低温微生物，如诺卡氏菌属(Nocardia)[10]、假单胞菌属(Pseudoalteromonas)[11]、沙门氏菌属(Salmonella)[12]、红球菌属(Rhodococcus)[13]、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)[14]等菌株，对脂肪烃和多环芳烃表现出较好的降解效果。
目前，国内外采用单一菌株进行石油污染土壤的生物修复的研究报道较多，实际应用中难以达到理想的修复效果。微生物菌群的协同修复不仅能显著提高石油的降解效率，而且适用于石油污染土壤的原位修复[2]。研究发现，与单一细菌相比，以食碱菌(Alcanivora)和解环菌(Cycloclasticus)为优势菌株的土著菌群对石油表现出更高的降解率[15]。
本研究旨在探索人工构建低温石油降解菌群，在反应器中实现快速石油降解，同时通过在线监测反应器中CO2和O2的浓度变化来评价石油降解效果，探索并优化石油污染土壤原位修复的过程控制参数及条件。
1 实验部分
1.1 实验材料
样品来源：本研究中所用样品来自(121°60′N、40°47′E)的石油污染土壤，总油浓度为181.93 mg/g，主要污染物为C10—C38的正构烷烃，含量约为79.73 mg/g。
培养基：MM培养基(无碳源)：MgSO4·7H2O 3.5 g/L，CaCl2 0.05 g/L，NaCl 5 g/L，KCl 0.35 g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，Na2HPO4 1.0 g/L，pH 7.5。MM琼脂培养基为MM基础培养基外加15 g/L琼脂。LB培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.5。
1.2 石油降解菌株的富集及筛选
称取5 g土壤样品于装有50 mL无菌水的250 mL三角瓶中，15 ℃，150 r/min条件下振荡7 d后，取3 mL土壤悬液加入装有含2%(w/V)原油MM培养基(30 mL)的250 mL三角瓶中，15 ℃，150 r/min条件下振荡7 d；吸取1 mL培养液加入至装有含2%(w/V)原油MM培养基(30 mL)的250 mL三角瓶中，15 ℃，150 r/min条件下振荡培养10 d，2轮重复后，取100 μL培养液，梯度稀释，涂布含2%原油的MM平皿，15 ℃培养72 h，挑取单菌落，接种LB琼脂培养基，15 ℃培养48 h，4 ℃冰箱短期保存；LB培养基的培养物接种LB液体培养基，15 ℃，150 r/min条件下培养12 h，培养液与50%的甘油1∶1混匀，冻存于-80 ℃冰箱。
1.3 菌种鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程公司)提取菌株DNA，利用细菌16S rRNA通用引物1492R(5′-GGTACCTTGTTACGACTT-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)进行PCR扩增。PCR体系(50 μL)：DNA模板2 μL，正反向引物各1 μL，dNTP 4 μL，10× PCR 缓冲液5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，纯水36.8 μL。PCR条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min 30个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物送至北京华大基因公司测序，结果提交至NCBI数据库。
1.4 低温细菌的石油降解特性分析
1.4.1 温度对细菌降解石油的影响
LB培养基固体培养物，PBS缓冲液洗脱，稀释至OD600=0.5。以5%的接种量接种至含1%原油MM培养基(30 mL)的250 mL三角瓶中，分别在15，25，37 ℃条件下，150 r/min振荡培养15 d，每隔12 h培养液取样进行OD600测定，每组实验设置无原油对照。
1.4.2 细菌对不同石油烃的降解能力分析
LB培养基固体培养物，PBS缓冲液洗脱，稀释至OD600=0.5，以5%的接种量接种至含2 g/L环己烷、2 g/L正十六烷或0.1 g/L菲为唯一碳源MM培养基(30 mL)的250 mL三角瓶中，15 ℃，150 r/min条件下振荡培养7 d，每隔12 h培养液取样进行OD600测定，7 d后对培养液中的残余石油烃浓度进行测定；每组实验设置无菌对照。
培养液中的残余正十六烷和环己烷分别用正己烷和二甲苯进行萃取，利用赛默飞Trace 1300气相色谱仪进行定量测定[16, 17]。培养液中的残余菲用乙酸乙酯进行萃取，利用安捷伦1290 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪进行定量测定[16]。
1.5 低温细菌产表面活性剂能力分析
将生长对数期的菌液分别接种至含1%原油、含1%原油与0.03%鼠李糖脂的30 mL MM培养基中，15 ℃，150 r/min振荡培养15 d，每隔12 h培养液取样进行OD600测定。每组实验设置无菌对照。培养5，10，15 d后，将只含原油培养基的全部培养液转移至50 mL离心管，8000×g离心10 min，将除去菌体和原油后的中层液体转移至培养皿，用配备有25 N测力传感器的质构仪(TMS-Pilot，FTC，USA)，采用圆盘探头对样品的表面张力进行测定，每个样品重复测定3次。
1.6 低温菌群的石油降解分析
采用德国SAXON Infralyt 80多组分尾气分析仪，对5 L发酵罐中低温菌群的石油降解过程中的CO2和O2浓度进行实时在线监测，以15 ℃、5 d内CO2产量和O2消耗量的动力学曲线表征菌群的石油降解能力，并对添加鼠李糖脂生物表面活性剂及25 ℃条件下的石油降解进行测定与分析，每组实验设置无菌对照。
2 结果与讨论
2.1 菌种鉴定结果
从石油污染土壤中筛选得到7株石油降解菌，可在15 ℃时，以原油为唯一碳源的培养基中良好生长。经形态学鉴定，7株细菌均为革兰氏阴性。7株细菌的16S rDNA鉴定比对结果如表1所示。
表1 7株石油降解菌鉴定结果
Table 1 Identification and contrast of seven oil-degrading bacteria strains
菌编号菌属种名相似度/%Genbank登录号JLH001节杆菌属Arthrobactersulfonivorans99MK691447JLH002不动杆菌属Acinetobacterbaumannii100MK691448JLH003假单胞菌属Pseudomonasfragi100MK691449JLH004苍白杆菌属Ochrobactrumpituitosum98MK691450JLH005不动杆菌属Acinetobactercalcoaceticus100MK691451JLH006节杆菌属Arthrobacteroxydans97.5MK691452JLH007拉恩氏菌属Rahnellaaquatilis99.93MK691453
2.2 菌株的石油降解特性
2.2.1 温度对石油降解细菌生长的影响
不同温度下，不同菌株在原油培养基中的生长情况如图1所示。可知：在15，25 ℃下，JLH 001、JLH 003和JLH 004菌株的生长均优于37 ℃；其余4个菌株，在15，25，37 ℃下，生长差异不大，基于微生物生长的最适温度，7株分离细菌均属于兼性嗜冷菌。
—15 ℃； 
—25 ℃； 
—37 ℃； 
—对照。
图1 7株细菌在1%原油培养基中不同温度下的生长曲线
Figure 1 Growth curve of seven isolated strains in 1% crude oil medium at different temperature
2.2.2 石油烃对低温细菌生长的影响
图2为7株菌株在正十六烷、环己烷、菲中的生长情况。可知：不同菌株在不同烃化合物培养基中的生长速度及生长量不同；同时，不同菌株在相同烃化合物培养基中的生长能力差异较大。菌株JLH 001、JLH 002和JLH 006以3种石油烃为碳源时生长能力均较强，而菌株JLH 007和JLH 003的生长能力相对较差。
2.2.3 低温细菌对不同石油烃的降解能力
图3为7株细菌对以正十六烷、环己烷、菲作为石油烃类的代表化合物的降解情况。可知：7株细菌对环己烷的降解率在55%左右，无显著性差异。JLH 001，JLH 002和JLH 006对正十六烷的降解能力较强，降解率>20%，高于文献[18]报道的15%。JLH 003对菲的降解率达到40%；除JLH 004和JLH 007外，其余4株细菌对菲的降解率均>25%，与文献[19]报道的20%处于同一水平，比假单胞菌W12稍低[20]。
—JLH 001； 
—JLH 002； 
—JLH 003； 
—JLH 004； 
—JLH 005； 
—JLH 006； 
—JLH 007； 
—对照。
图2 15 ℃下7株细菌在正十六烷，环己烷和菲培养基中的生长曲线
Figure 2 Growth curve of 7 isolated strains in presence of hexadecane, cyclohexane and phenanthrene at 15 ℃
环己烷； 
正十六烷； 
菲。
注：误差线表示标准差，不同字母表示不同菌株间的差异，P<0.05。
图3 7株细菌15 ℃下培养7 d对不同石油烃类的降解
Figure 3 Degradation of hexadecane, cyclohexane and phenanthrene by 7 isolated strains after incubating for seven days at 15 ℃
该结果与石油烃对分离细菌生长的影响一致，JLH 001、JLH 002与JLH 006在3种烃类培养基中生长良好，降解率也较高。
2.3 低温石油降解菌的产表面活性剂能力
2.3.1 添加表面活性剂对低温石油降解细菌生长的影响
石油烃的生物可利用性是影响微生物降解石油的关键因素，而石油烃的疏水性是限制其生物可利用性的重要条件之一[21]。鼠李糖脂对不同菌株在石油中生长的影响如图4所示。可知：添加鼠李糖脂对菌株JLH 001、JLH 003和JLH 006的生长影响较小，延迟期有利于菌体的生长，平衡期降低了菌株生长量，这与文献报道一致，即一定浓度的鼠李糖脂会对假单胞菌CICC 20575吸收正十六烷产生抑制作用[22]。其余4株细菌，添加鼠李糖脂对其生长均表现出明显的促进作用。
—外加鼠李糖脂； —未加鼠李糖脂； —对照。
图4 15 ℃下添加鼠李糖脂对7株细菌在1%原油培养基中生长的影响
Figure 4 Effects of adding rhamnolipid on growth of 7 isolated strains in 1% crude oil media at 15 ℃
2.3.2 低温细菌培养液表面张力变化
7株细菌在原油培养基中培养不同时间后，表面张力变化如图5所示。可知：培养5 d后，7株细菌的培养液表面张力均明显降低，其中JLH 006降低最明显；10 d后，培养液表面张力进一步降低；15 d后，表面张力降低情况更明显，其中JLH 001、JLH 003和JLH 004的表面张力降低显著。JLH 001和JLH 006的产表面活性剂能力最强，致表面张力降低最快，与文献[23, 24]报道结果一致，添加表面活性剂对其在石油中的生长并无明显促进作用。
5 d； 10 d； 15 d。
注：误差线表示标准差，字母表示不同菌株间的差异，P<0.05。
图5 15 ℃下7株细菌在1%原油培养基中的表面张力变化
Figure 5 Surface tension change of seven isolated strains culture at 15 ℃ incubation in 1% crude oil media
2.4 低温菌群的石油降解
根据筛选的7株低温细菌对石油不同成分的降解能力，构建了6组低温石油降解菌群，并对菌群的石油降解情况进行了测定。这6组菌群分别为：
菌群CST 111：JLH 001，JLH 002，JLH 003，JLH 006；菌群CST 222：JLH 001，JLH 002，JLH 004，JLH 006；菌群CST 333：JLH 001，JLH 003，JLH 004，JLH 006；菌群CST 444：JLH 001，JLH 003，JLH 006，JLH 007；菌群CST 555：JLH 001，JLH 002，JLH 006，JLH 007；菌群CST 666：JLH 001，JLH 004，JLH 006，JLH 007。
利用尾气分析仪对菌群的石油降解过程中CO2浓度与O2浓度进行实时在线监测，表征菌群的石油降解能力。
2.4.1 不同菌群的石油降解特性
图6为15 ℃时不同菌群降解1%原油时CO2产生和O2消耗情况。可知：在15 ℃下，反应器石油降解过程中CO2增加曲线与O2消耗曲线变化一致，但不同菌群的CO2增加量与O2消耗量均表现出明显差异。其中，菌群CST 111表现出最高的石油降解能力，在48 h左右CO2产量和O2消耗量达到最高，分别为2.22%和6.27%，在72 h左右2种曲线渐趋于平缓，降解达到终点。菌群CST 333的CO2产量与O2消耗量在48 h左右达到最高。菌群CST 555最早进入降解完全阶段，在34 h左右达到降解终点，对石油的降解速度最快。
—CST 111； 
—CST 222； 
—CST 333； 
—CST 444； 
—CST 555； 
—CST 666； 
—对照。
图6 15 ℃下不同菌群降解1%原油时CO2的产生和O2的消耗变化
Figure 6 CO2 production and O2 consumption of crude oil degradation by different microfloras at 15 ℃
2.4.2 添加生物表面活性剂对菌群石油降解特性的影响
图7为添加鼠李糖脂对不同菌群降解1%原油CO2产生量和O2消耗量的影响。在15 ℃下添加鼠李糖脂后，菌群CST 666降解原油的CO2产量与O2消耗量最大，29 h达到峰值，分别为0.94%和2.11%；34 h菌群的CO2产量与O2消耗量趋于稳定，即进入了降解完成阶段，说明添加鼠李糖脂提高了菌群CST 666的石油降解率和降解速度，促进其降解。其他5个菌群，添加鼠李糖脂后降解石油的CO2产量与O2消耗量与图6未添加鼠李糖脂时相比，均大幅降低，鼠李糖脂对这些菌群的原油降解并未产生促进作用，即鼠李糖脂抑制了这些菌群中某些菌株在原油中的生长。
—CST 111； —CST 222； —CST 333； —CST 444； —CST 555； —CST 666； —对照。
图7 15 ℃下添加鼠李糖脂对不同菌群降解1%原油CO2产生和O2消耗影响
Figure 7 Effects of adding rhamnolipid on CO2 production and O2 consumption of crude oil degradation by different microfloras at 15 ℃
2.4.3 25 ℃下不同菌群的石油降解特性
图8为25 ℃不同菌群降解1%原油时CO2产生和O2消耗情况。可知：在25 ℃下，菌群CST 111、CST 333和CST 444表现出较强的石油降解能力，比15 ℃下(图6)更早地达到CO2产量与O2消耗量的最高值，菌群CST 111和CST 333提前了约20 h进入降解完成阶段；温度对CST 444降解速度的促进效果则更为明显。一定程度的升温可以提高某些菌群的石油降解速度。
—CST 111； —CST 333； —CST 444。
图8 25 ℃下不同菌群降解1%原油时CO2产生和O2消耗变化
Figure 8 CO2 production and O2 consumption of crude oil degradation by different microfloras at 25 ℃
3 结 论
1)在15 ℃下以原油为唯一碳源，从石油污染土壤中筛选得到7株石油降解菌；形态学及16S rDNA菌株鉴定，最适生长温度分析证明其均为兼性嗜冷细菌。
2)基于7株低温细菌对正十六烷、环己烷和菲这3种石油烃的降解特性及产生物表面活性剂能力，构建了6组低温石油降解菌群，由Arthrobacter sp. JLH 001、Acinetobacter baumannii JLH 002、Pseudomonas fragi JLH 003、Arthrobacter sp. JLH 006组成的菌群CST 111的石油降解能力最强，在15 ℃时，生物反应器中1%的原油培养基在第2天达到石油降解最高点，第3天进入降解完成阶段；添加鼠李糖脂生物表面活性剂、提高温度可以在一定程度上提高菌群的石油降解速度。
[1] VARJANI S J. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons [J]. Bioresource Technology, 2017, 223: 277-286.
[2] 李宝明. 石油污染土壤微生物修复的研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2007.
[3] 张学佳，纪巍，康志军，等. 石油类污染物对土壤生态环境的危害[J]. 化工科技, 2008, 16(6): 60-65.
[4] CHANDRA S, SHARMA R, SINGH K, et al. Application of bioremediation technology in the environment contaminated with petroleum hydrocarbon [J]. Annals of Microbiology, 2013, 63(2): 417-431.
[5] MECKENSTOCK R U, BOLL M, MOUTTAKI H, et al. Anaerobic degradation of benzene and polycyclic aromatic hydrocarbons [J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2016, 26(1/2/3): 92-118.
[6] ZHANG Z Z, HOU Z W, YANG C Y, et al. Degradation of n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons in petroleum by a newly isolated Pseudomonas aeruginosa DQ8 [J]. Bioresource Technology, 2011, 102(5): 4111-4116.
[7] COSTA A S, ROMAO L P, ARAUJO B R, et al. Environmental strategies to remove volatile aromatic fractions (BTEX) from petroleum industry wastewater using biomass [J]. Bioresource Technology, 2012, 105: 31-39.
[8] SOUZA E C, VESSONI-PENNA T C, Oliveira R P S. Biosurfactant-enhanced hydrocarbon bioremediation: An overview [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2014, 89: 88-94.
[9] 杜亚鲁, 胡韬, 彭琳. 土壤石油污染的生物修复技术研究进展[J]. 环境科学与技术, 2017, 40(增刊1): 133-138.
[10] ABBASIAN F, LOCKINGTON R, MALLAVARAPU M, et al. A comprehensive review of aliphatic hydrocarbon biodegradation by bacteria [J]. Applied Biochemistry Biotechnology, 2015, 176(3): 670-699.
[11] WILKES H, BUCKEL W, GOLDING B T, et al. Metabolism of hydrocarbons in n-alkane-utilizing anaerobic bacteria [J]. Journal of Molcular Microbiology and Biotechnology, 2016, 26(1/2/3): 138-151.
[12] GHAZALI F M, RAHMAN R N Z A, SALLEH A B, et al. Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2004, 54(1): 61-67.
[13] JANBANDHU A, FULEKAR M H. Biodegradation of phenanthrene using adapted microbial consortium isolated from petrochemical contaminated environment [J]. Journal of Hazardous Materials, 2011, 187(1/2/3): 333-340.
[14] MITTAL A, SINGH P. Isolation of hydrocarbon degrading bacteria from soils contaminated with crude oil spills [J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2009, 47(9): 760-765.
[15] HARAYAMA S, KASAI Y, HARA A. Microbial communities in oil-contaminated seawater [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2004, 15(3): 205-214.
[16] 赵晓秀, 赵慧敏, 全燮, 等. 石油污染土壤中菲、蒽和正十六烷的微生物降解[J]. 生态学杂志, 2009,28(3):456-460.
[17] 钱奕忠. 微生物降解石油废水的研究[D]. 北京: 北京化工大学, 2001.
[18] 朱杰, 阮志勇,董卫卫，等. 一株高效烷烃降解菌Acinetobacter sp.LAM1007的分离鉴定及降解特性[J]. 微生物学通报, 2017，44(7)：1535-1546.
[19] 温文静, 谭丽婵, 雒晓芳, 等. 嗜碱性假单胞菌对菲的降解研究[J]. 西北民族大学学报(自然科学版), 2016，37(3):58-61.
[20] 徐成斌, 王闻烨, 李鲜珠, 等. 一株菲降解菌的鉴定及降解特性[J]. 环境科学学报, 2015, 35(3):684-691.
[21] 杨乐. 产表面活性剂解烃菌的筛选及其降解条件研究[J]. 环境工程, 2015(6):153-157.
[22] LIU Y, ZENG G M, ZHONG H, et al. Effect of rhamnolipid solubilization on hexadecane bioavailability: enhancement or reduction? [J]. Journal of Hazardous Materials, 2017, 322(Pt B): 394-401.
[23] IN
S, MNIF, DHOUHA G. Glycolipids biosurfactants; potential related biomedical and biotechnological applications[J]. Carbohydrate Research, 2015.
[24] 李敬龙, 刘晔, 潘爱珍. 生物表面活性剂及其应用[J]. 齐鲁工业大学学报, 2004, 18(2):41-46.