0 引 言
黑臭水体的污染和治理现已成为社会关注热点[1],水体所散发出的臭气主要有氨气、硫化氢、硫醇及不饱和脂肪酸等，其中氨气是最主要的成分[2-4]；水体中的致黑物质主要是由固体形态和溶于水中带色有机化合物所组成[5-6]。黑臭水体不仅严重影响河流生态系统，而且对城市景观和人体健康产生不良影响，传统的物理和化学治理方法虽然见效快但费用高，且易对水体造成二次污染[7-10]。近年来利用微生物技术净化修复黑臭水体逐渐受到业界的重视。
许多研究表明，好氧反硝化细菌对水体具有净化修复作用。蔡昌凤和梁磊[11]从湖北某焦化废水厂生化处理站曝气池中的活性污泥筛选出1株高效好氧反硝化细菌，该细菌对焦化废水COD具有明显的降解效果。刘芳[12]从不同来源的海水中分离纯化出5株好氧反硝化细菌，通过脱氨氮、亚硝态氮的对比实验，获得1株高效好氧反硝化细菌，该细菌在pH为7.5的环境条件下对水体氨氮降解率可达83.25%。金少锋[13] 从养殖池塘水体中筛选出的菌株8F-3具有很强的反硝化功能，经12 h的反硝化作用，氨氮去除率为95.98%，经测序鉴定，该菌株为不动杆菌属。除此之外，研究人员对约氏不动杆菌的特性也进行了许多深入的研究。连丽丽等[14]对约氏不动杆菌进行聚磷特性的研究，将筛选出的菌株CH-1在好氧条件下,以富磷培养液培养72 h后,培养液中磷浓度由10 mg/L降至3.476 mg/L,对磷降解率高达65.24%。苏丹[15]的研究表明约氏不动杆菌是耐冷菌，可在相对温度较低的条件下生长并保持一定的生物降解能力，可以转化和降解低温水体中的污染物，对寒冷地区污染水体的净化修复有着重要意义。约氏不动杆菌对环境中的多环芳烃也具有降解效果，由马丹[16]从含油废水中所筛选出的约氏不动杆菌F-1对多环芳烃菲的降解率可达43.57%。
本试验拟从银川市西夏区西大沟黑臭水体中分离微生物并测定其净化效果，以期为黑臭水体的净化修复提供菌种资源。
1 试验部分
1.1 材 料
1.1.1 水体背景和菌株来源
银川市西夏区西大沟位于106°9′15″E，38°31′17″N，总长度为13.20 km，始于第二污水厂，向东汇入四二干沟，其中城市建成区黑臭段为3 km。菌株分离自宁夏银川市西夏区西大沟黑臭水体。供试水体不同月份污染基本情况见表1。
表1 不同月份黑臭水体污染情况
Table 1 Pollution status of black and odorous water body
in different months
月份ρ(NH3-N)/(mg·L-1)ρ(COD)/(mg·L-1)水体浊度/FTUρ(DO)/(mg·L-1)水温/℃32.8928.848.40.9 12.442.9729.769.90.9 14.653.6630.2210.71.0 15.363.2237.239.61.0 23.874.9254.49.71.2 27.185.8936.777.82.0 29.792.2427.626.42.3 20.1102.3230.966.72.1 12.2
1.1.2 培养基
富集培养基：KNO3，1 g；KH2PO4，1 g；FeCl2，0.05 g；CaCl2，0.2 g；MgSO4·7H2O，1 g；溴百里酚蓝(1%溶于乙醇)[17]；蒸馏水1 L。
分离培养基：KNO3，1 g；KH2PO4，1 g；FeCl2，0.05 g；CaCl2，0.2 g；MgSO4·7H2O，1 g；溴百里酚蓝(1%，溶于乙醇)；琼脂，20 g；蒸馏水,1 L。
LB培养基：胰蛋白胨，10 g；酵母浸粉，5 g；NaCl，5 g；琼脂，20 g；蒸馏水,1 L。
NA培养基：蛋白胨，10 g；NaCl，5 g；牛肉浸膏，5 g；琼脂，20 g；蒸馏水,1 L。
1.2 方 法
1.2.1 好氧反硝化细菌的富集
取10 mL供试水样接种于200 mL富集培养基中，于30 ℃，175 r/min的摇床中振荡3 d后,再取5 mL富集液于新富集培养基中，连续富集3次[18]。
1.2.2 好氧反硝化细菌的分离纯化
从上述富集培养液中取1 mL于灭菌试管并加入9 mL无菌水稀释后，均匀涂布在分离培养基平板上，30 ℃恒温培养箱中培养24 h。选择长势良好、形态不同的菌株，采用平板划线方式纯化3～4次，得到4株菌，4 ℃冰箱保存，分离培养过程中设空白无菌对照平板。
1.2.3 高效反硝化细菌的筛选
取纯化好的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨[18]中，30 ℃，175 r/min振荡培养3 d后，将菌液以5000 r/min离心7 min获得高密度菌体，并将其调节为OD600=1的菌悬液。然后取5%的菌悬液分别置于供试水体中，在30 ℃，175 r/min振荡培养2 d后[20]，测定水体中氨氮含量，筛选对黑臭水体去除氨氮效果最好的菌株。每个处理设3次重复，同时设空白对照。
1.2.4 形态学鉴定
菌株形态学鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》[21]进行。
1.2.5 生理生化鉴定
生理生化测定项目主要包括接触酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、反硝化试验、明胶液化试验、产硫化氢试验、脲酶试验、脂酶试验，以上测定均参照《常见细菌系统鉴定手册》[22]进行。
1.2.6 分子生物学鉴定
将纯化好的菌株保存至试管斜面，送北京生工测16S rDNA序列，将测序结果提交至GenBank进行Blast分析，并在NCBI上通过Bankit在线提交的方式获得菌株登录号。
1.2.7 菌株生长曲线与黑臭水体净化性能测定
将菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30 ℃，pH=7.0，175 r/min振荡培养7 d，每24 h测定1次OD600吸光值，绘制其生长曲线。取4 ℃保存的菌株BJTNXUAD010接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基活化培养24 h，离心后将其配制为OD600=1的菌悬液，然后取5%的菌悬液于300 mL供试黑臭水体中，在30 ℃、175 r/min条件下振荡培养2 d后，分别用重铬酸钾法[23]、纳氏试剂光度法[24]、浊度仪和溶解氧测定仪测定水样COD、NH3-N、水体浊度和DO。
1.2.8 数据统计分析
所有数据利用Spss statistics软件进行统计分析，图、表分别运用Origin 8.5和Excel制作，系统发育树用软件MEGA 7.0制作。
2 结果与分析
2.1 高效反硝化细菌的分离与筛选
取西大沟黑臭水体进行好氧反硝化细菌分离，经菌落形态观察和去除NH3-N试验，共得到4株对水体NH3-N有去除效果的菌株，如图1所示。可知：菌株BJTNXUAD010、BJTNXUAD011、BJTNXUAD012、BJTNXUAD013的ρ(NH3-N)分别为0.33，0.06，1.41，3.40 mg/L，其中菌株BJTNXUAD010脱氨氮效果最好，NH3-N降解率为89.04%。牟东阳等[25] 在1株异养硝化-好氧反硝化细菌DK1的分离鉴定及其去氮特性研究中发现，其对废水氨氮的降解率为94.69%。陈钊等[26]在循环水养殖系统中分离出好氧反硝化细菌，对水体氨氮降解率达到89.42%。
图1 不同菌株处理黑臭水体后氨氮含量
Fig.1 Ammonia nitrogen content of water treated by different strains
4种菌株对供试水体NH3-N、COD、浊度、DO的显著性影响结果见表2。在0.05水平上，经菌株BJTNXUAD010处理后的NH3-N浓度与对照相比，差异极显著；菌株BJTNXUAD011和BJTNXUAD012处理后的NH3-N浓度与对照相比较，差异显著；菌株BJTNXUAD013虽对氨氮有降解作用，但降解效果不显著。菌株BJTNXUAD011和BJTNXUAD010对水体COD的降解效果均显著，而株菌BJTNXUAD012、BJTNXUAD013处理后的水体COD浓度不但没有下降，反而有上升趋势。该4种菌株对水体浊度和DO浓度也具有影响，其中BJTNXUAD010和BJTNXUAD011对水体浊度的降解程度和溶解氧提高程度分别为极显著和显著，但其菌株间对水体浊度的变化差异不显著。在0.01水平上，各菌株对黑臭水体净化修复的差异性表现与在0.05水平上的相一致。经过综合分析，菌株BJTNXUAD010对黑臭水体净化效果最佳。
表2 不同菌株处理间显著性比较
Table 2 Significance comparison among treatments
by different strains
菌株编号ρ(NH3-N)/(mg·L-1)ρ(COD)/(mg·L-1)浊度/FTU(DO)/(mg·L-1)BJTNXUAD0100.38±0.01 dCD10.49±0.18 dD3.53±0.03 dD2.33±0.03 aABJTNXUAD0110.59±0.03 cC14.93±0.39 cC3.63±0.03 dD1.70±0.06 bBBJTNXUAD0121.41±0.02 bB28.37±0.26 bB8.43±0.03 bB1.20±0.06 cCBJTNXUAD0133.40±0.02 aA35.45±0.26 aA7.40±0.12 cC1.23±0.03 cCCK3.45±0.04 aA28.07±0.12 bB9.70±0.06 aA0.87±0.03 dD
注：不同小写字母代表在0.05水平上差异显著，相同小写字母代表在0.05水平上差异不显著；不同大写字母代表在0.01水平上差异显著，相同大写字母代表在0.01水平上差异不显著。
2.2 菌株形态学观察
选取高效菌株BJTNXUAD010平板培养24 h进行菌落形态观察(图2)，菌落直径为0.5～1 mm，菌落圆形、隆起、白色、表面光滑、有光泽，革兰氏染色阳性，短杆状。
图2 菌株BJTNXUAD010平板
Fig.2 Image of strain BJTNXUAD010 plate
2.3 生理生化鉴定
菌株BJTNXUAD010生理生化鉴定结果见表3，对照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定该菌株属于不动杆菌。
表3 菌株BJTNXUAD010的生理生化特征
Table 3 Physiological and biochemical characteristics
of strain AD010
测定项目接触酶甲基红V-P测定硝酸盐还原反硝化脲酶明胶液化脂酶硫化氢淀粉水解结果++-++++---
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2.4 分子生物学鉴定及其系统发育关系
将菌株BJTNXUAD010的16S rDNA序列提交至Genbank进行Blast分析可知，该菌株与约氏不动杆菌相似性高达99%，菌株登录号为MK024657。菌株BJTNXUAD010系统发育树如图3所示。
图3 菌株BJTNXUAD010系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of strain BJTNXUAD010
2.5 菌株生长曲线测定
将菌株BJTNXUAD010在30 ℃，pH=7.0，175 r/min条件下培养，每隔24 h测定1次菌液OD值，详见图4。可以看出：菌株前期生长缓慢，24 h后呈对数增长趋势，在105 h左右到达峰值0.785，之后进入衰亡期。
图4 菌株BJTNXUAD010的生长曲线
Fig.4 Growth curve of strain BJTNXUAD010 in cultivation
2.6 菌株BJTNXUAD010对黑臭水体的净化效果
取5%，OD600=1的菌悬液接种于供试黑臭水体中，连续7 d测定水体中COD、NH3-N、浊度以及DO的影响。由图5可看出：BJTNXUAD010在第2～4天进入对数增长期，COD降解率急剧增加，第4天后降解率虽有增加但效果不明显，其间最大降解率达到72.36%。菌株BJTNXUAD010对黑臭水体NH3-N的降解率在第1天较低，第2～5天逐渐增高，第5天达到峰值89.96%，之后降解率逐渐下降并趋于平稳。随着时间的延长，菌株BJTNXUAD010对黑臭水体浊度的去除率逐渐增大，第5天达到峰值67.12%，之后浊度反而上升,可能是由于菌体死亡引起。DO含量从第1～7天持续呈增加趋势，并在第7天到达峰值141.38%。
—各参数变化率； 
—CK。
图5 菌株BJTNXUAD010对黑臭水体净化修复效果
Fig.5 Effect of strain BJTNXUAD010 on purification of
black and odorous water bodies
3 结 论
试验从银川市西大沟黑臭水体中筛选出4株菌均对黑臭水体NH3-N有降解效果，其中以菌株BJTNXUAD010(约氏不动杆菌)的净化修复效果最为显著，从水体COD、NH3-N、浊度的去除率以及DO增长率来看，该菌株属于高效型反硝化细菌，可在4～5 d内将COD、NH3-N、浊度3个污染指标降至最低。在筛选出的其他菌株中，BJTNXUAD011对黑臭水体净化效果同样显著，但经分子鉴定该菌株为铜绿假单胞菌，属于致病菌。所以，菌株BJTNXUAD010在黑臭水体微生物治理技术以及微生物净化修复剂的研制中有着广阔的应用潜力。除此之外，研究表明许多约式不动杆菌具有耐冷性，在低温条件下可对NH3-N进行有效去除。今后针对菌株BJTNXUAD010可进一步研究其在低温环境下对水体NH3-N的净化效果，为低温环境导致微生物活性降低或失活现象的瓶颈打开突破口。
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